pH值对原代大鼠肝细胞冻存效果的影响

付建柱 张立军 于则利

近30年的动物实验和临床研究证明，对各种原因引起的急性肝功能衰竭和由于肝代谢酶缺陷引起的遗传型代谢性疾病，肝细胞移植(hepatocytes transplantation，HT)是有效的治疗手段之一［1］。肝细胞移植要求有高效率的肝细胞分离、保存方法［2］。但目前关于肝细胞分离和保存的技术操作仍有很多问题需要解决［3］。本实验针对pH值对大鼠肝细胞保存效果的影响进行研究，以求能提高肝细胞保存效率。

材料与方法

1．实验材料:(1)实验动物:纯系雄性SD大鼠20只，鼠龄为3～4个月，体重为250～300g。(2)实验试剂:Belzer UW液为美国Bristol－Myers squibb公司产品，胎牛血清为杭州市四季青生物工程公司产品，台盼蓝和四唑盐购自美国Sigma公司，RPMI1640培养液购自GIBCO公司，D－HANKS液为协和医科大学基础实验室提供，其余试剂均为国产分析纯。(3)实验仪器:台盼蓝、四唑盐、胶原酶Ⅳ等购于美国Sigma生物公司，戊巴比妥钠为中国医药集团上海化学试剂公司生产，D－Hank's液为中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学实验室提供，胎牛血清为杭州市四季青生物工程公司产品，RPMI－1640培养液为美国Gibco产品。二氧化碳培养箱(MCO175)为日本SANYO公司产品，pH酸度计为德国Inolab公司产品，分光光度仪为美国Bio－Rad公司产品，细胞培养瓶、吸管、离心管、96孔细胞培养板等为丹麦Nunc公司产品。

2．实验方法:(1)肝细胞的分离:参考Seglen两步胶原酶灌注法分离肝细胞［4］。在无菌操作条件下，分离、结扎胆总管和肝动脉;门静脉远端结扎，近端置18G穿刺导管并固定，连接启动循环灌流装置后，分离下腔静脉并插管，剪开胸腔夹闭肝上下腔静脉。用37℃水浴预热的无Ca2+的D－Hank's液(含125U/m l肝素，pH值调至7．4)进行灌注，灌流速度30ml/min，灌注时间10min，此时肝脏应均匀发白，然后用含0．05%胶原酶和7．5mmol/L氯化钙(CaCl2)的 D－Hank's液灌注10min，灌注速度5ml/min，至肝包膜下组织呈龟背状裂隙，两步灌注时间共约20min左右。取下消化成熟的肝脏，轻轻撕去包膜，将肝细胞置入预冷4℃的D－Hank's液中，200目滤网过滤，制备成肝细胞悬液。以50g的离心速度离心5min，共离心3次。把收获的肝细胞保存在含10%胎牛血清的RPMI－1640保存液中备用。将肝细胞悬液取样在光镜下计数，计算肝细胞产量，并用台盼蓝染色法测定肝细胞存活率。控制此过程时间在60min。(2)配制冻存液:冻存液为含12%二甲基亚砜(DMSO)、20%胎牛血清(FBS)的UW液和RPMI 1640液，预先分别用5%碳酸氢钠溶液和0．1mmol/L盐酸溶液调节其 pH 值为 7．1、7．4、7．7。(3)实验分组:共分为 6 组，1、2、3 组为 UW 液组，pH 值分别为7．1、7．4、7．7。4、5、6 组为 RPMI 1640 组，pH 值分别为 7．1、7．4、7．7。(4)肝细胞的冷冻保存:取新制备的肝细胞悬液，转移至冷冻保存液中，冷冻保存液为含20%胎牛血清和12%二甲基亚砜(DMSO)的RPMI－1640细胞保存液，调节细胞最终浓度为5．0×106/m l，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，将细胞移入无菌塑料冷冻保存管中，每管为2ml。将冷冻保存管4℃ 放置15min，－20℃ 放置30min，－80℃放置12h，然后移入－196℃液氮中保存。(5)肝细胞的复苏:分别于7、14、28天后，将冷冻保存期满的细胞从液氮中取出，快速放入预热至37℃的温水浴中，并不时摇动使其尽快在1min内融化。50g速度离心5min，取上清液测定LDH浓度，细胞加入含5%DMSO的细胞培养液冲洗，50g速度离心3min，去上清液，再加入含2%DMSO的细胞保存液冲洗，离心，去上清液，最后，用不含DMSO的细胞保存液进行冲洗。离心后，去上清液，将细胞浓度调整至4×105个/毫升备用。

3．实验指标检测:(1)肝细胞活率的测定:用台盼蓝染色法在倒置显微镜下计数3次，取平均值，通过计算活细胞数及总细胞数再计算出肝细胞的存活率。(2)肝细胞保存液乳酸脱氢酶(LDH)浓度的测定:肝细胞样本复苏操作后，每份样本第1次离心后取上清液测定LDH浓度。(3)四唑盐(MTT)比色试验:将肝细胞用含10%胎牛血清的细胞培养液配成肝细胞悬液浓度为5×103个/毫升，以每孔1000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μl。将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，培养24h后，每孔加入MTT溶液20μl(5mg/m l)，继续孵育4h，终止培养，翻板法弃去孔内培养上清液。然后培养板每孔加入150μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，校正波长630nm，在分光光度计上测定各孔数值，记录结果。

4．统计学方法:应用SPSS 16．0统计分析软件包，用平均值±标准差记录各组检查结果，各组之间用单因素方差分析(Bonferroni检验)进行比较。以P＜0．05认为有显著统计学差异。

结 果

1．分离细胞的活率:分离的肝细胞平均数目为2．8×108。用台盼蓝染色法计数分离细胞活率平均为 92．28%。

2．冻存一定时间后复苏的各组肝细胞存活率:由表1可见，各组中，存活率以pH值7．4和pH值7．7组最高，在第7天时，以pH值7．4组为最高，与其他两组有明显统计学差异(P＜0．05)，而在14、28天时pH值7．4与pH值7．7没有明显统计学差异(P＞0.05)，均明显高于pH值7．1组 (P＜0．05)。

3．冻存一定时间后复苏的各组肝细MTT试验结果:各组中，MTT实验以 pH值7．4组为最高，但与pH值7．7组没有统计学差异(P＞0．05)，两组均明显高于pH值7．1组，有明显统计学差异(P＜0．05)。UW液保存的肝细胞MTT实验结果在7、14、28天均明显高于RPMI 1640液(用pH值7．4的两组比较)，有统计学差异(P＜0．05)，见表2。

表1 各组肝细胞存活率(%)

表2 各组肝细MTT试验结果

4．冻存一定时间，解冻后冻存液LDH浓度:各组中，LDH浓度以pH值7．4与pH值7．7组最低，两组没有明显统计学差异(P＞0．05)，均明显高于pH值7．1组，有明显统计学差异(P＜0．05)。UW 液保存的肝细胞的LDH浓度在7、14、28天均明显低于RPMI 1640液组(用pH值7．4的两组比较)，有统计学差异(P ＜0．05)，见表3。

表3 冻存液LDH浓度(U/L)

讨 论

目前的研究表明，肝细胞移植可用于治疗肝衰竭及多种肝脏相关的遗传性代谢缺陷疾病。它还是实施肝脏导向体外基因治疗的工具，基因技术的发展将对其产生巨大影响［5］。肝细胞移植的疗效在一定程度上与肝细胞的质量有直接的联系，但目前肝细胞分离、保存技术仍不完善，缺少统一的标准［6］。保存肝细胞的成功与否取决于分离技术、细胞保存液、冷冻技术、降温速度和冷冻保护剂等［7］。本实验用pH值不同的冻存液进行细胞冷冻保存，以期能对肝细胞的保存方法有所改进。

细胞低温保存过程中，有氧代谢中止，无氧酵解过程代偿增强，酵解产生的乳酸蓄积;ATP分解过程中也会产生H+(MgATP2－→MgADP－+Pi2+H+);同时胞质Ca2+增多，可促使Ca2+进入线粒体并与其中的磷酸结合，在结合过程中也产生H+［3Ca2++，这些变化都会导致细胞内酸中毒，表现为细胞内pH值的下降［8］。细胞内酸中毒的进展及pH值下降能抑制糖酵解关键酶1，6－二磷酸果糖激酶，减少细胞内ATP储存，改变细胞能量代谢状态，最终对保存细胞的活力产生影响。同时细胞内H+浓度升高，H+－K+交换增加，导致细胞内K+蓄积。细胞酸中毒还可直接或间接破坏膜系统的功能和结构，导致细胞的损伤，甚至死亡。维持在中性或略偏碱性的保存液有利于细胞内的H+通过一系列复杂的跨膜转运机制向细胞外流动，缓解细胞内的酸中毒，使肝细胞内pH值保持稳定。同时保存液保持中性或偏碱，可以促进K+内移，减轻K+的细胞毒作用。这样的pH值环境还能减轻对糖酵解关键酶1，6－二磷酸果糖激酶的抑制，减慢ATP分解。从而提高肝细胞存活能力［9］。本实验也证明了这一点，无论是在UW液还是1640液，中性和碱性环境的保存效果都明显优于偏酸性环境，在较长期(14、28天)，这种分别更加明显。

虽然在肝移植和肺脏低温灌注的研究表明，偏碱性的灌注液的保存效果要优于中性灌注液，但在本实验中没能观察到这种结果，仅在28天后的标本检测中，偏碱性的UW保存组的LDH漏出要少于其他组，但没有统计学差异。这可能是因为细胞在冻存时的代谢水平较器官移植时更低，因而细胞内的酸中毒程度较轻，可以被保存液中的缓冲系统代偿。但在长期保存时，细胞的酸中毒超过保存液的缓冲能力，必然会导致细胞损伤。所以在长期细胞保存时，选用缓冲能力强的保存液或使用偏碱性的保存液将能改善细胞的保存效果。

同时在实际的操作中，要取得精确控制的pH值是很难的，这就在很多时候需要我们有一定的趋向。本实验结果表明，在略偏碱性pH值7．7环境中，肝细胞的冻存效果接近于中性环境。偏酸性环境pH值7．1不利于肝细胞的长期保存。也提示细胞保存液应当设置在pH值7．4或略偏碱性。

本实验也可以发现，虽然保存液的pH值是影响肝细胞保存的一个因素，但同时我们在各组数据的对比中可以发现，各组之间结果的差距并不是很大，这说明pH值是影响肝细胞保存效果的一个因素，但可能并不是关键因素，还需要研究其他因素对肝细胞保存效果的影响，以求能进一步改进肝细胞的保存技术。

1 Dhawan A，Strom SC，Sokal E，etal．Human hepatocyte transplantation［J］．Methods Mol Biol，2010，640:525 － 534

2 Puppi J，Strom SC，Hughes RD，et al．Improving the techniques for human hepatocyte transplantation:report from a consensusmeeting in london［J］．Cell Transplant，2011

3 Soltys KA，Soto－Gutierrez A，Nagaya M，et al．Barriers to the successful treatment of liver disease by hepatocyte transplantation［J］．J Hepatol，2010，53(4):769 －774

4 Seglen PO．Preparation of isolated rat liver cells［J］．Methods Cell Biol，1976，13:29 － 83

5 Fitzpatrick E，Mitry RR，Dhawan A．Human hepatocyte transplantation:state of the art［J］．J Intern Med，2009，266(4):339 － 357

6 Puppi J，Dhawan A．Human hepatocyte transplantation overview［J］．Methods Mol Biol，2009，481:1 －16

7 Terry C，Dhawan A，Mitry RR，etal．Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation［J］．Liver Transpl，2010，16(2):229 － 237

8 Mitry RR，Lehec SC，Hughes RD．Cryopreservation ofhuman hepatocytes for clinical use［J］．Methods Mol Biol，2010，640:107 － 113

9 SosefMN，Baust JM，Sugimachi K，etal．Cryopreservation of isolated primary rat hepatocytes:enhanced survival and long－term hepatospecific function［J］．Ann Surg，2005，241(1):125 －133