伊马替尼对慢性粒细胞白血病患者T细胞的影响研究

刘晓蕾，梁嘉妮，梁珊妮，刘永建，姚海英，蔡 怡

（1.保定市第一中心医院 血 液内科，河北 保 定071000；2.保定市第二医院，河北 保 定071000；3.河北大学附属医院，河北 保 定071000）

甲磺酸伊马替尼是临床上治疗慢性粒细胞白血病（CML）的一线抗癌药，通过竞争性抑制酪氨酸激酶而有效地治疗CML。而免疫细胞激活和分化需要ABL酪氨酸激酶的激活，伊马替尼可能通过阻断该信号途径抑制免疫功能。本研究通过体外实验探讨伊马替尼对慢性粒细胞白血病患者T淋巴细胞增殖和活性的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

30例慢性粒细胞白血病患者外周血细胞的PMI－1640培养液购自上海丽臣生物科技有限公司，10%胎牛血清购自Sigma公司，尼龙毛柱购自日本WAKO，植物血凝素（PHA）购自上海生工，二甲基亚砜（DMSO）购自 millipore，伊马替尼（Imatinib）购自Selleck公司，四甲基偶氮唑盐（MTT）购自sigma公司，抗人CD 3单克隆抗体、FITC标记的CD 69、CD 25和藻红蛋白（PE）标记的HLA－DR单克隆抗体购自Epigenbiotech。

1.2 方法

1.2.1 T细胞采集与处理 从2006－2011年在我院治疗的在治和随访的慢性粒细胞白血病患者中选出年龄45～50岁病情相似的慢性粒细胞白血病患者30例，取外周血细胞50 ml，用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞。PBS洗涤后，用RPMI－1640完全培养液在96孔板上培养，并调整浓度为3X 106／ml，随机分为对照组和处理组。两组样本同时加入PHA（5 μg／ml）、抗CD 3单克隆抗体（60 ng／ml）。处理组加入用DMSO溶解的浓度为5μmol／L的伊马替尼，对照组中加入等量的DMSO。在37C、5%CO2和湿润的条件下培养。每隔1天换液半量，并补充等浓度的PHA、抗CD3单克隆抗体和伊马替尼。

1.2.2 MTT法检测T细胞增殖和活性 MTT法能够通过OD值反映细胞的存活和生长，OD值与细胞数量成正比。在加入伊马替尼之前和加入之后24 h、48 h和72 h后分别加 MTT（5 mg／ml）检测T细胞增殖和活性。用酶标仪在450 nm处测各孔OD值。所有标准孔及样品均作复孔。

1.2.3 ELISA法检测T细胞分泌的细胞因子IFN－γ 72 h后，取上述上清液，采用ELISA方法检测IFN－γ的浓度。所有标准孔及样品均作复孔。

1.2.4 流式细胞术检测T细胞表面活性标记 用流式细胞仪标记液PBA（PBS＋10%BSA＋0.02%叠氮钠）悬浮T细胞，分别加入CD 25、CD 69和HLADR单克隆抗体标记，通过流式细胞仪检测细胞表面活性标记。

1.3 统计处理

所有实验数据用（x－±s）表示 ，用SPSS l3.0统计软件对结果进行t检验。P＜0.05为显著性检验标准。

2 结果

2.1 T细胞增殖和活性

与对照组相比，Imatinib加入前处理组OD值没有显著性差异（P＞0.05），Imatinib加入24 h、48 h和72 h后差异有显著性（P＜0.05）。见表1和图1。

表1 伊马替尼对T淋巴细胞增殖活性的影响（OD值）（x－±s）

2.2 T细胞分泌的IFN－γ

72 h后，经过ELISA测得对照组和处理组IFN－γ的浓度分别为（6.39±0.96）和（2.83±0.46）ng／m，两者有显著性差异（P＜0.05）。

图1 伊马替尼对T淋巴细胞增殖活性的影响

2.3 T细胞表面活性标记

通过流式细胞仪检测，处理组和对照组的CD25、CD69和HLA－DR表面免疫活性标记均有显著性差异（P＜0.05）。见表2和图2。

表2 伊马替尼对T淋巴细胞表面免疫活性标记表达的影响（%）（x－±s）

图2 伊马替尼对T淋巴细胞表面免疫活性标记表达的影响

3 讨论

慢性粒细胞白血病（CML）是骨髓增殖性疾病之一，其致病基因因素是9号和22号染色体的转位t（9；22）（q34；q11），因而导致BCR—ABL融合酪氨酸激酶失去抑制，过度表达激酶。［1］伊马替尼是人工合成的的强有力的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI），通过选择性结合bcr／abl蛋白的ATP结合位点竞争性抑制abl的酪氨酸激酶使活性降低，从而阻断下游多条信号传导通路，慢性粒细胞白血病得到有效的治疗。［2］业已证实，伊马替尼不仅对CML有效，对其他由于酪氨酸激酶持续激活而引起的恶性肿瘤也有效：Ph＋ 急性淋巴细胞白血病、血小板源性生长因子受体（PDGFR）突变引起的骨髓增殖性疾病、干细胞生长因子受体c－KIT突变引起的胃肠间质肿（GIST）［3－5］。伊马替尼是属于靶向分子的治疗方法，是治疗CML的一线抗癌药物，它相比一般的化疗药物对癌细胞更有选择性。［6］然而临床上通过伊马替尼治疗CML患者过程中以及随访中，已发现恶性肿瘤和感染发生率增高的情况。例如，Mattiuzzi GN等［7］发现给予伊马替尼治疗CML的病人发生带状疱疹的几率增加，用抗病毒的药物症状消失。Bekkenk MW等［8］报道一位病人用了伊马替尼后发生EB病毒感染的B细胞淋巴瘤。Miyachi K等［9］发现风湿关节病病人并发2个月的CML之后用伊马替尼治疗后关节炎得到缓解。Tybulewicz VL［10］等使用了 ABL－／－敲基因的小鼠，其作用机制与伊马替尼相同，发现小鼠胸腺和脾脏萎缩，出现T细胞和B细胞造成的淋巴细胞减少症。这些报道或直接或间接说明伊马替尼有抑制免疫功能的副作用。因此深入研究其副作用并进一步指导临床用药越来越必要。

本研究通过细胞培养、MTT法检测T细胞增殖和活性、ELISA法检测T细胞分泌的细胞因子、流式细胞术检测T细胞表面活性标记等方法和过程来探讨伊马替尼对慢性粒细胞白血病患者T细胞影响。

T细胞增殖和活性实验中，无论伊马替尼加入前处理组OD值与对照组没有显著性差异，说明伊马替尼加入前处理组和对照组的条件是一致的。而伊马替尼加入后的24h、48h、72h处理组与对照组有显著性差异，说明伊马替尼能够抑制T细胞的增殖。Allan B.Dietz［11］等通过体外培养健康捐献者的T细胞，发现使用CML患者相似治疗浓度的伊马替尼能抑制T细胞的增殖，用植物血凝素非特异性刺激之后表现更明显，而且伊马替尼并不杀死T细胞和诱导T细胞凋亡。Cwynarski［12］等发现人T细胞和伊马替尼在体外进行共培养时，T细胞的增殖能力随着伊马替尼浓度的增大而逐渐下降，即使用抗CD3单抗和植物血凝素刺激实验组T细胞，其增殖能力也并没有反转。并且两种刺激所产生的抑制程度之间没有差异。利用流式细胞技术中的标记物annexin—V来检测细胞凋亡情况，没有T细胞的凋亡增加的现象。提示伊马替尼的抑制作用和T细胞凋亡无关。以上两者结果与本研究基本一致。通过ELISA法检测T细胞分泌的细胞因子IFN－γ，处理组和对照组IFN－γ分泌量有显著性差异，说明伊马替尼能抑制T细胞活化为效应T细胞，因而抑制了T细胞细胞因子的分泌。T细胞表面活性标记的检测中，处理组和对照组的CD25、CD69、HLADR表面免疫活性标记均有显著性差异。，进一步说明伊马替尼抑制T细胞激活为效应T细胞。

本实验研究结果说明伊马替尼能够抑制T细胞的增殖和活化，使得效应T细胞减少，免疫功能受到抑制，因而发生感染和癌症的几率增大。K Cwynarski［13］的研究结果与本研究基本一致，伊马替尼在体外实验中抑制了T细胞的增殖和活化。这对临床上用药具有指导意义，在伊马替尼治疗CML的同时还应该辅以增强免疫的药物。

［1］周 鹭，刘 红.达沙替尼治疗耐伊马替尼慢性粒细胞白血病2例报告［J］.交通医学，2009，23（1）：60.

［2］许 娜，杜庆锋，杨 军，等.酪氨酸激酶抑制剂对淋巴细胞生物学特性影响的研究［J］.国际免疫学杂志，2010，33（2）：152.

［3］Demetri GD，von Mehren M，Blanke CD，et al.Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors［J］.N Engl J Med，2002（347）：472.

［4］Magnusson MK，Meade KE，Nakamura R，et al..Activity of STI571 in chronic myelomonocytic leukemia with a platelet－derived growth factor beta receptor fusion oncogene［J］.Blood，2002（100）：1088.

［5］Cools J，De Angelo DJ，Gotlib J，et al.A tyrosine kinase created by fusion of the PDGFRA and FIP1L1 genes as a therapeutic target of imatinib in idiopathic hypereosinophilic syndrome［J］.N Engl J Med，2003，348：1201.

［6］Christiane I－U Chen，Holden T，Maecker，et al.Lee.Development and dynamics of robust T－cell responses to CML under imatinib treatment［J］.2008 111（11）：5342.

［7］Mattiuzzi GN，Cortes JE，Talpaz M，et al.Development of varicella－zoster virus infection in patients with chronic myelogenous leukemia treated with imatinib mesylate［J］.Clin Cancer Res，2003，9：976.

［8］Bekkenk MW，Vermeer MW，Meijer CJLM，et al.EBV－positive cutaneous B－cell lymphoproliferative disease after imatinib mesylate［J］.Blood，2003（102）：4243.

［9］Miyachi K，Ihara A，Hankins RW，Murai R，Maehiro S，Miyashita H.Efficacy of imatinib mesylate（STI571）treatment for a patient with rheumatoid arthritis developing chronic myelogenous leukemia［J］.Clin Rheumatol，2003（22）：329.

［10］Tybulewicz VL，Crawford CE，Jackson PK，et al.Neonatal lethality and lymphopenia in mice with a homozygous disruption of the c－abl proto－oncogene［J］.Cell，1991（65）：1153.

［11］Allan B Dietz，Lina Souan，Gaylord J.Knutson，et al.Imatinib mesylate inhibits T－cell proliferation in vitro and delayed－type hypersensitivity in vivo［J］.Blood，2004，104（4）：1094.

［12］Cwynarski K，Laylor R，Macehiarulo E，et al.Imatinib inhibits.the activation and proliferation of normal T lymphocytes in vitro［J］.Leukemia，2004，18（8）：1332.

［13］K Cwynarski，R Laylor，E Macchiarulo，et al.Imatinib inhibits the activation and proliferation of normal T lymphocytes in vitro［J］.Leukemia，2004（18）：1332.