大孔树脂吸附分离紫苏茎总黄酮的工艺研究

吴元锋，孟耀庭，毛建卫，黄 俊，刘士旺

（1.浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，杭州310023）

紫苏（Pefilla frutescens（L.）Britt）别名赤苏、红苏、红紫苏、香苏，系唇形科紫苏属一年生草本植物，目前中国各地均有栽培，主产于江苏、安徽、湖南等地，分布于全国20多个省（自治区、直辖市），具有极为广泛的资源价值，是中国传统的药食植物，且富含黄酮类化合物［1］。紫苏叶、茎、籽可分别入药，药效各有不同，紫苏叶具有解表散寒，行气和胃功效；紫苏梗具有理气宽中，止痛，安胎功效；紫苏籽具有降气消痰，平喘，润肠功效［2］。李秀信的实验表明，紫苏茎中含有黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类和二氢黄酮醇类等多种黄酮类化合物［3］。

国内已有学者对大孔树脂吸附纯化紫苏总黄酮［4］、紫苏叶总黄酮［5］、白苏的地上部分总黄酮［6］等工艺进行了研究。本研究以紫苏茎总黄酮为原料，选用5种不同类型的吸附树脂D-101、AB-8、DM130、ADS-7和ADS-17进行试验，通过静态吸附筛选出最适合紫苏茎总黄酮纯化的大孔树脂，然后对上样总黄酮质量浓度、上样速率、解吸浓度、洗脱速率等进行动态吸附试验，得出优化的分离工艺，为大孔树脂吸附分离紫苏茎总黄酮奠定基础。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

T6新世纪紫外现代分光光度计，RE-200型旋转蒸发器，SHZ-CB型循环水式多用真空泵，数显恒温水浴锅，自动部分收集器，电子天平，GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱。

1.1.2 材料与试剂

原料：紫苏茎，产自浙江衢州。

标准品：二水栎精（纯度98%），购自上海阿拉丁。

主要试剂：无水乙醇、冰醋酸、石油醚、醋酸钠、无水三氯化铝均为分析纯。

大孔树脂：D-101、AB-8、DM130、ADS-7、ADS-17，购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗提物的制备

粉碎干燥紫苏样品，以60%乙醇为提取剂，料液比为1∶30，提取时间为60min，提取温度50℃，进行超声波辅助提取，得到紫苏提取液，将紫苏提取液浓缩得浸膏。

1.2.2 标准曲线的绘制

采用氯化铝法：二水栎精标准品（纯度98%）用50%乙醇配成0.1mg／mL溶液，分别精密吸取该标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于25mL容量瓶中，加8mL1.5%三氯化铝溶液与4mL pH 5.5的醋酸钠缓冲液，然后用50%乙醇溶液定容，静置0.5h后，于紫外分光光度计415nm处测定，得回归方程Y＝0.519 6 X＋0.033 1，R2＝0.995 2。

1.2.3 树脂静态吸附量及解吸率的测定

三角瓶中加入经过预处理的D-101、AB-8、DM130、ADS-17和ADS-7大孔树脂各2g，加入质量浓度为0.46mg／mL的紫苏黄酮提取液各30mL，置于25℃摇床上震荡24h后测溶液未被吸附的黄酮含量，按下式计算静态吸附量：

式中：A1—黄酮吸附量，mg／g；C0、C1—初始、残余黄酮质量浓度，mg／mL；V—料液体积，mL；W—大孔树脂质量，g。

根据树脂的吸附量，选择2种吸附率较大的树脂，加入70%的乙醇后放入摇床解吸，根据下式计算解吸率：

式中：A2—解析率；C2、C3—吸附饱和时，解吸液黄酮质量浓度，mg／mL。

1.2.4 大孔树脂静态吸附曲线

大孔树脂滤至没有水流出，精确称取2g大孔树脂放入100mL三角瓶中，加入30mL紫苏茎总黄酮提取液（质量浓度为0.46mg／mL），放入25℃摇床中进行吸附实验，每1h吸取1mL溶液，分光光度法测定溶液中黄酮含量，共吸附12h，得出大孔树脂静态吸附曲线。

1.2.5 大孔树脂吸附紫苏茎总黄酮工艺的确定

1.2.5.1 上样黄酮质量浓度对吸附的影响 分别配制质量浓度为0.46、0.15、0.05mg／mL的黄酮溶液，大孔树脂湿法装柱，用大量水淋洗后分别上样3种不同质量浓度黄酮溶液，每1柱床体积（BV）收集1瓶，上样流速为1BV／h，直至流出液黄酮质量浓度为上样液的1／10（即穿透）。

1.2.5.2 上样流速对吸附的影响 选择上样液质量浓度为0.15mg／mL，依次用0.6、1、2BV／h流速上样，测定流出液黄酮质量浓度，直至流出液黄酮质量浓度为上样液的1／10。

1.2.5.3 乙醇质量分数对洗脱的影响 大孔树脂经过紫苏黄酮吸附饱和后，分别用50%、70%、90%的乙醇溶液洗脱，流速为1BV／h，分别测定流出液黄酮质量浓度，得出解吸曲线。

1.2.5.4 乙醇洗脱速率对洗脱的影响 大孔树脂经过紫苏黄酮吸附饱和后，分别以1BV／h、2BV／h、3BV／h流速洗脱，乙醇质量分数为70%，分别测定流出液黄酮质量浓度，得出解吸曲线。

2 结果与讨论

2.1 大孔树脂对紫苏茎总黄酮的吸附量

按1.2.3方法，分别计算出5种大孔树脂对总黄酮的静态吸附量，结果见表1。

由于大孔树脂极性、孔径、比表面积、孔容等不同，故不同的大孔树脂对吸附分离的影响很大。在所选择的5种大孔树脂中，D-101是非极性，AB-8是弱极性，DM130是中等极性，ADS-7和ADS-17是极性大孔树脂。从表1可以看出，5种型号大孔树脂中，以AB-8对吸附量最高，其次是D-101，这可能是由于AB-8是弱极性吸附树脂，因此对于极性较弱的总黄酮有较好的吸附性能。非极性的D-101树脂对总黄酮也有较好的吸附效果。而中等极性和极性的大孔树脂对紫苏黄酮吸附效果较差。在下面的解析率实验中，选取AB-8和D-101树脂进一步实验。

表1 大孔树脂对紫苏茎总黄酮的吸附量Table 1 Adsorption capacity of macroporous resin to total flavonids of stem of Pefilla frutescens

2.2 大孔树脂对紫苏茎总黄酮的解吸率

静态吸附实验中吸附饱和的AB-8、D-101大孔树脂用70%乙醇解吸12h，其解吸率结果见表2。从表2可以看出，从吸附量和解吸率来看，AB-8树脂都优于D-101树脂。这是因为紫苏茎总黄酮是弱极性物质，在弱极性柱上更容易被吸附，同时可能是由于比表面积较大的原因，也较容易被洗脱，故解析率更高，因此在静态吸附和动态吸附实验中，选择AB-8为吸附树脂。

表2 AB-8、D-101大孔树脂的解吸率Table 2 Desorption capacity of macroporous resin AB-8and D-101

2.3 AB-8对紫苏茎总黄酮静态吸附曲线绘制

选择AB-8大孔树脂，按1.2.4方法，测定不同时间总黄酮浓度，绘制静态吸附曲线，如图1所示。从图1中可看出，总黄酮的初始质量浓度为0.46mg／mL，1h后即降到0.29mg／mL，但此后吸收率变化开始变小，3h后吸附率基本趋于稳定，吸附量不再明显变化。

2.4 不同上样质量浓度对AB-8吸附的影响

按1.2.5.1方法，试验不同上样质量浓度对AB-8大孔树脂吸附性能的影响，结果见图2。

从上样质量浓度对吸附性能的影响来看，上样总黄酮质量浓度为0.46mg／mL时，穿透点出现最早，在6BV附近即可穿透，此时总黄酮质量浓度较高，可能造成大孔树脂使用周期短，树脂再生次数增多；而上样总黄酮质量浓度为0.05mg／mL时，穿透点出现最晚，在11BV附近才穿透，这将会使生产周期过长；上样总黄酮质量浓度0.15mg／mL时，穿透点出现在8BV附近。因此，选择最佳上样质量浓度为0.15mg／mL。

2.5 不同上样速率对AB-8吸附性能的影响

进样质量浓度为0.15mg／mL时，对不同上样速率下进行大孔树脂吸附性能试验，3种不同上样流速下的吸附性能如图3所示。由图3可知，上样流速在0.6BV／h时，穿透点出现最晚，在11BV处才穿透；上样流速为1BV／h时，穿透点在8BV处出现；而上样流速为2BV／h时，6BV处即可实现穿透。黄酮溶液越慢通过树脂柱，越能和树脂充分接触，从而提高吸附效果，但是流速慢会导致整个吸附时间大大延长。而流速太快，导致穿透点过早出现，吸附效果也会变差，紫苏茎总黄酮在树脂上吸附量会变小。因此，从工业化生产成本上综合考虑，取上样流速为1BV／h，此时吸附效果较好，生产周期也较短。

2.6 不同乙醇质量分数洗脱对AB-8洗脱性能的影响

按1.2.5.3方法，依次采用3种不同质量分数的乙醇溶液对大孔树脂进行洗脱，解吸曲线见图4。

从不同质量分数乙醇溶液对洗脱效果的影响来看，总的效果是乙醇质量分数越高，总黄酮洗脱的速率越快，但差别不是很大。另外，还测定了3种质量分数乙醇溶液的洗脱率，50%、70%、90%质量分数乙醇溶液对总黄酮的洗脱率分别为87.79%、95.35%、91.56%。综合来看差别不大，但是乙醇质量分数选在70%稍好。

2.7 不同洗脱速率对大孔树脂洗脱性能的影响

按1.2.5.4方法，选择3种洗脱流速进行洗脱，洗脱曲线如图5所示。

从图5中可以看出，洗脱速率越快，总黄酮出峰时间越早。洗脱流速为3BV／h时，洗脱体积为2 BV时黄酮质量浓度即达到最大；洗脱流速为2BV／h时，对应的洗脱体积为3BV；而洗脱流速为1BV／h时，洗脱体积为4BV后流出液总黄酮质量才开始下降。另外，测定了3种洗脱流速下总黄酮的洗脱率，洗脱速率下为1、2、3BV／h时，AB-8大孔树脂对总黄酮的洗脱率分别为95.35%、93.56%和76.67%。因此，洗脱速率为3BV／h时，出峰时间最短，但洗脱率最低；洗脱速率为1BV／h时，洗脱率最高，但是出峰时间最长，而且拖尾严重，生产周期较长。因此，选择最佳洗脱速率为2BV／h。

2.8 大孔树脂吸附后总黄酮纯度比较

根据氯化铝法测定吸附前后黄酮的含量，得出大孔树脂吸附前紫苏茎总黄酮纯度为11.3%；经过大孔树脂吸附纯化后的总黄酮纯度为50.7%，说明AB-8树脂适合分离以紫苏茎为原料提取得到的总黄酮。

图5 不同洗脱流速对AB-8洗脱性能的影响Fig.5 Effect of elution rate on desorption capacity of macroporous resin AB-8

3 结 语

本研究从吸附性能、上样质量浓度、上样速率、洗脱浓度、洗脱速率等方面考察了紫苏茎总黄酮的分离工艺。静态吸附试验表明，AB-8大孔树脂对紫苏茎总黄酮的吸附量较高；动态吸附试验表明，上样速率与上样质量浓度分别为1BV／h和0.15mg／mL，乙醇洗脱的质量分数为70%，洗脱速率为2BV／h时，总黄酮洗脱率为93.56%，总黄酮纯度可提高4.5倍。

［1］ 刘大川，王静，苏望懿，等.紫苏的开发研究及进展［J］.武汉工业学院学报，2000（4）：1-3.

［2］ 邹盛勤，刘坤，陈武.紫苏不同部位中乌索酸和齐墩果酸的含量比较［J］.食品工业科技，2008（4）：284-286.

［3］ 李秀信，汪晓峰，王兰珍，等.紫苏茎中黄酮类化合物的提取及鉴定［J］.西北农业学报，2002，11（4）：49-51.

［4］ 聂犇，余陈欢，王芳芳，等.大孔树脂分离纯化紫苏总黄酮的工艺研究［J］.中华中医药学刊，2008（2）：423-425.

［5］ 胡晓丹，孙爱东，徐瑞聪，等.大孔吸附树脂纯化紫苏叶总黄酮的研究［J］.中药材，2009（3）：438-441.

［6］ 王薇，余陈欢，刘晶晶，等.大孔树脂吸附纯化白苏总黄酮的工艺研究［J］.食品科技，2009，34（1）：152-155.