Runx2介导TGF－β1调控成釉细胞MMP20基因表达的研究

孙学玲，孙 岩，张娟娟，赵 娜，梁广智，刘晓影，成 敏，高玉光

(山东潍坊医学院口腔医学研究所，山东潍坊 261053)

金属基质蛋白酶－20(matrix metalloproteinase 20，MMP20)是牙齿特异性表达的蛋白酶，在牙釉质蛋白的降解中发挥主要的作用。有研究表明［1］，MMP20基因敲除小鼠的牙釉质矿化程度及硬度均显著降低。我们在以往研究中发现［2－3］TGF－β1参与了牙釉质发育并调控成釉细胞MMP20基因的表达。为进一步研究TGF－β1调控MMP20的分子机制，本实验观察了转录因子Runx2在TGF－β1调控MMP20基因表达中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

小鼠成釉细胞系(日本Akita大学Sugiyama教授馈赠);双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒、TransFastTMTransfection Reagent(Promega公司);RNAiso Plus、MutanBEST Kit、蛋白酶 K(TaKaRa 公司);SYBR Green PCR Master Mix(Roche公司);TGF－beta1(Perotech Inc公司);胰蛋白酶、DMEM培养基(Hyclone公司);胎牛血清(杭州四季青公司);割胶回收试剂盒、质粒小抽提取试剂盒、pepstatin、aprotinin9(BBI公 司);IQ5TMPCR 仪(Bio－Rad 公 司 );SirinsL Tube Luminometer(Berthold公司);protein A agarose beads(Upstate公司);质粒 PGL3－basic、内参照质粒 pRL40均为实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

小鼠成釉细胞系(ALC)常规复苏后，用DMEM(含100 mL/L胎牛血清)培养液在37℃、50 mL/L CO2、饱和湿度条件下进行培养并传代，细胞传至5代以上，用于实验。

1.2.2 双荧光素酶报告基因检测

待细胞长满至70% ～80%时，按照TransFastTMTransfection Reagent操作说明书进行质粒转染。以PGL3－basic为阴性对照，pRL40为内参对照，实验分4 组。组1:PGL3－basic;组2:PGL3－basic+TGF－beta1;组 3:PGL3－MMP20;组 4:PGL3－MMP20+TGF－beta1;其中PGL3－MMP20为本实验室克隆并保存的鼠MMP20启动子不同长度的荧光素酶表达载体的质粒。待培养30 h后，加入0.5 ng/mL TGF－β1，继续培养3 h。成釉细胞裂解前先用PBS洗涤1次，再用100 μL细胞裂解液PLB裂解细胞;在加样管加入100 μL的Luciferase Assay ReagentⅡ(LARⅡ)，吸取20 μL细胞裂解液与之混匀，并加样于荧光素酶检测仪，检测10 s时的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)激发底物释放荧光的数值U1。然后加入100 μL 的stop＆Glo Reagent，检测样品中海肾荧光素酶(Renilla luciferase)激发底物释放荧光的数值U2。每一样品均取U1/U2之值为该质粒报告基因的荧光素酶相对活性，每组3个样本，重复3次。

1.2.3 染色体免疫共沉淀

利用TFSEARCH、AliBaba 2.1工具分析得到Runx2结合的特异性序列“TGTGGG”，该位点位于MMP20启动子－383～－375区域内。针对这一潜在结合位点设计引物，上游 P1:5’－ATTCTTTTACAATAGGATGC－3’;下游 P2:5’－TTCAGTGACTCTTTACTCTTTA－3’。预计片段为 163 bp，由宝生物工程大连有限公司合成。反应条件94℃4 min，94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 20 s，34个循环后72℃延伸5 min。取成釉细胞用终浓度为10 mL/L的甲醛溶液在37℃下固定10 min，裂解细胞并取上清液，用超声波将DNA破碎至500 bp左右后，实验组按浓度1∶500滴加兔抗鼠Runx2抗体(Santa Cruz公司)，同时IgG组滴加等浓度的羊抗兔无关抗体，阴性对照不加任何抗体，4℃孵育过夜，琼脂糖珠A沉淀离心，收集蛋白质染色体免疫复合物，经解交联、消化蛋白后，每组取等量DNA纯化液用PCR进行DNA鉴定。其中阳性对照组取等量DNA破碎原液为模板。

1.2.4 基因突变及双荧光素酶报告基因载体的构建

根据MutanBEST Kit试剂盒说明设计5’端邻接，3’端方向相反的引物，用以导入突变位点。将Runx2结合位点由“TGTGGG”突变为“TGTAAG”。上游引物 P3:5’－CCTGTAAGTGCAAATAAAGAGTAAAG－3’;下游引物 P4:5’－CAAGCCTGATGACCTGGGTT－3’;以本实验室克隆并保存的鼠MMP20启动子序列(－488～+23)为模板;将导入突变位点的启动子序列连至PGL3－basic，经酶切测序鉴定正确后，命名质粒为 PGL3－MMP20(－488～ +23)－MUT。

1.2.5 Western Blot

待Runx2 siRNA和control siRNA(均为实验室保存)转染成釉细胞60 h后，裂解细胞，并提取蛋白上清，经SDS－PAGE、半干转印，转移到硝酸纤维素滤膜上(转印条件15 V，转印时间25 min)，用兔抗鼠的Runx2抗体与膜上的蛋白进行抗原抗体反应，ELC试剂盒检测。

1.2.6 实时定量 RT－PCR

以成釉细胞提取的总RNA逆转录的cDNA为模板，进行实时定量PCR，用于检测MMP20基因表达的改变。引物序列:内参对照GAPDH，F:5'－ TGTGTCCGTCGTGGATCTGA－3';R:5'－TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG －3';MMP20，F:5'－GGCGAGATGGTGGCAAGAG－3';R:5'－CTGGGAAGAGGCGGTAGTT－3'。反应条件94℃ 4 min，94℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 25 s，80℃ 15 s采集荧光，40个循环后72℃延伸5 min。反应在IQ5TMPCR仪进行，每个样本3个复孔，重复3次。用配对t检验分析实时定量RT－PCR结果。

2 结果

2.1 TGF－β1调控成釉细胞MMP20启动子的转录活性

首先观察TGF－β1对MMP20启动子的转录活性的影响。待细胞长满至70% ～80%，分别将PGL3－basic或 PGL3－MMP20(图 1a)与 pRL40 质粒共转染30 h 后，加入0.5 ng/mL TGF－β1，继续培养3 h。TGF－β1刺激成釉细胞后，PGL3－MMP20荧光活性在－87～+23区域无明显变化外，其他各区域活性均上调，其中－488～+23区域荧光素酶的活性显著增强(P﹤0.05)(图1b)。

图1 TGFβ－1调控成釉细胞MMP20启动子的转录活性

2.2 Runx2调控成釉细胞MMP20启动子的转录活性

首先利用TFSEARCH、AliBaba 2.1工具分析得到Runx2结合的特异性序列“TGTGGG”，该序列“TGTGGG”位于MMP20启动子－383～－375区域内(图2a)。由图2b所示用PCR方法鉴定Runx2抗体沉淀分离出的特异性DNA序列。其中实验组与其他各组对照后，得到清晰显著的条带，与预计的大小相符，说明该位点“TGTGGG”是Runx2特异性结合位点。进一步将该位点突变后连至PGL3－Basic。以PMD 18 Simple T－MMP20(－488～ +23)(实验室保存)为模板，P3、P4为引物，扩增出约3203 bp大小的片段，经自身连接(环化反应)后，抽提质粒连至PGL3－Basic，酶切测序鉴定证实特异性结合位点“TGTGGG”突变为“TGTAAG”(图 2c、d)。最后将PGL3－MMP20(－488 ～ +23)－WT、PGL3－MMP20(－488～+23)－MUT与10 ng的Runx2共转染细胞30 h。与野生型MMP20启动子相比，Runx2结合位点的突变明显抑制MMP20启动子的活性(P﹤0.05)(图2e)。

2.3 TGF－β1和 Runx2 siRNA调控成釉细胞MMP20基因表达的研究

为进一步明确 Runx2参与介导 TGF－β1对MMP20基因表达的调控，首先Western Blot结果显示:成釉细胞中 Runx2蛋白表达水平显著减弱(图3a)。表明Runx2 siRNA有效阻断Runx2蛋白的表达。将Runx2 siRNA转染细胞60 h后，加入含TGF－β1(0.5 ng/mL)的 DMEM 培养基，继续培养3 h。Runx2基因沉默后，显著抑制 TGF－β1对成釉细胞MMP20 mRNA表达水平的上调作用(P ﹤0.05)(图3b)。

图2 Runx2调控成釉细胞MMP20启动子的转录活性

图3 Runx2介导TGF－β1调控MMP20基因的表达

3 讨论

Runx2是牙齿发育过程中起关键作用的转录因子之一，研究已证实［4－5］:Runx2基因表达缺陷小鼠无牙本质和釉质发生。临床上Runx2表达缺陷会导致锁骨颅骨发育不全［6－8］，而且牙齿成熟延迟，但Runx2在釉质发育中发挥作用的分子机制尚不清楚。在釉质发育过程中，TGF－β1信号通路参与了 MMP20 基因表达的调控［2－3］，并且TGF－β1与MMP20在釉质基质的分泌期与成熟期早期呈现共表达特征［3，9］，因此推测 Runx2 可能参与TGF－β1信号通路调控MMP20的表达。本实验以小鼠成釉细胞系为模型，首先利用双荧光素酶基因报告系统探讨了TGF－β1对不同长度MMP20启动子转录活性的影响。我们以往研究表明，TGF－β1参与了成釉细胞MMP20启动子转录活性的调控［3］。本研究通过荧光素酶分析进一步发现，对于不同长度MMP20启动子，TGF－β1的作用存在明显不同(图1b)。我们利用生物学信息工具分析了MMP20启动子，发现该启动子在－383～－375区域内存在潜在的Runx2结合位点“TGTGGG”，因此我们利用染色体免疫共沉淀技术观察了Runx2与MMP20启动子“TGTGGG”序列的相互作用(图2b)，进一步表明成釉细胞内Runx2与MMP20启动子存在相互作用。运用基因定点突变技术我们将“TGTGGG”突变为“TGTAAG”后，再利用双荧光素酶基因报告系统检测MMP20启动子转录活性。与野生型 MMP20启动子相比，Runx2上调MMP20转录活性的作用因Runx2位点的突变而不明显(图2e)，提示转录因子Runx2参与了调控MMP20启动子的转录活性。因此我们推测Runx2可能参与了成釉细胞MMP20基因的表达。我们将Runx2 siRNA片段转染成釉细胞后，Runx2蛋白表达水平下降，TGF－β1上调MMP20基因表达的作用显著减弱(图3)，表明Runx2介导TGF－β1调控MMP20基因的表达。本实验分别在基因转录和基因表达水平上探讨了Runx2在TGF－β1诱导MMP20基因表达中的作用机制，进一步阐明了釉质发育的分子调控机制。

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