原发性高血压患者血浆色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸浓度的变化

徐冰馨， 詹一鸣， 高平进， 朱鼎良， 赵建幸

(上海交通大学医学院附属瑞金医院上海市高血压研究所，上海 200025)

原发性高血压患者血浆色氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸浓度的变化

徐冰馨， 詹一鸣， 高平进， 朱鼎良， 赵建幸

(上海交通大学医学院附属瑞金医院上海市高血压研究所，上海 200025)

目的 通过测定血浆色氨酸(TRP)、犬尿氨酸(KYN)和犬尿喹啉酸(KYNA)浓度，探讨外周吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)和犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)活性与原发性高血压(EH)的关系。方法 采用高效液相色谱法(HPLC)测定100例EH患者和80名健康体检者(对照组)血浆TRP、KYN和KYNA浓度，计算产物/底物的百分比来评价酶活性，即IDO活性=KYN/TRP×100%，KAT活性=KYNA/KYN×100%。结果 EH组血浆TRP浓度为(59．85 ±9．89)μmol/L，明显高于对照组［(48．19 ±7．72)μmol/L，P ＜0．001］;KYN 浓度为(2．01 ±0．48)μmol/L，明显低于对照组［(2．17±0．43)μmol/L，P ＜0．05］。EH 组和对照组血浆 KYNA 浓度分别为(24．10±9．12)、(23．59 ±7．27)μmol/L，二者差异无统计学意义(P ＞ 0．05)。EH 组 IDO 活性为 3．40% ±0．85%，明显低于对照组(4．54% ±0．81%，P ＜0．001);而 KAT活性为 1．20% ±0．36%，明显高于对照组(1．09% ±0．27%，P ＜0．05)。EH 组血浆 TRP 浓度与年龄呈负相关(r= －0．316，P=0．001)，而对照组二者之间无明显相关性(r=－0．208，P=0．064)。EH组和对照组血浆IDO活性均与年龄呈正相关(EH组:r=0．264，P=0．008;对照组:r=0．305，P=0．006)。2组血浆KYN、KYNA浓度及KAT活性与年龄均无明显相关性。结论EH组血浆TRP浓度明显增高而KYN浓度明显降低，提示外周TRP-KYN代谢途径的IDO活性可能与EH有关。

色氨酸;犬尿氨酸;犬尿喹啉酸;吲哚胺2，3-双加氧酶;犬尿氨酸氨基转移酶;原发性高血压

色氨酸(TRP)是一种人体必需氨基酸。从食物摄入的TRP除参与蛋白质合成外，还通过5-羟色胺(5-HT)和犬尿氨酸(KYN)代谢途径在相关酶的催化下生成多种重要的生物活性物质，参与体内生理活动。超过95%的TRP在吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)催化下生成KYN［1］，然后在犬尿氨酸氨基转移酶(KAT)作用下生成犬尿喹啉酸(KYNA)，或在KYN羟化酶作用下转变成3-羟基犬尿氨酸，并进一步代谢为3-羟基邻氨基苯甲酸、喹啉酸等。有研究表明，TRP、KYN和KYNA对血压有调节作用。Wolf等［2］发现静脉注射低剂量TRP能引起自发性高血压大鼠(SHR)和血压正常的大鼠(WKY)血压升高。Wang等［3］研究证明静脉给予KYN能呈剂量依赖性地降低SHR的平均动脉压(MAP)，内皮细胞表达的IDO活性增强时血中TRP浓度降低，KYN浓度升高，导致血压降低，而通过使用药物抑制IDO活性能增加实验动物的血压，IDO基因缺乏小鼠的MAP显著高于对照组。KYNA是N-甲基D-天门冬氨酸受体(NMDAR)拮抗剂，能够拮抗由谷氨酸和NMDAR介导的调节作用。有动物实验结果表明KYNA可能与血压的中枢调节有关［4］，其对血压调节的作用位点位于延髓头端腹外侧区(RVLM)的血压中枢调控区，通过调控该区域NMDAR完成。有研究显示SHR的肾皮质KAT活性低于相同周龄的WKY，且尿中KYNA含量亦显著低于WKY［5］。

原发性高血压(EH)是最常见的心血管疾病，占高血压的95%以上，是以体循环动脉压升高为主要特点，由多基因遗传、环境及多种危险因素相互作用所致的全身性疾病，其发病机制至今尚未完全明确。目前关于TRP-KYN代谢途径与血压调节相关性的研究工作多见于动物实验，在高血压患病人群中的研究尚未见报道。我们使用高效液相色谱法(HPLC)测定EH患者血浆TRP、KYN和KYNA浓度并通过计算KYN/TRP和KYNA/KYN比值得到IDO和KAT活性，以探讨其与EH的关系。

材料和方法

一、研究对象

1．对照组 选择瑞金医院体检中心的健康体检者80名，男39名，女41名，年龄23～69岁。

2．EH组 选择瑞金医院高血压科的住院患者100例，男50例，女50例，年龄18～84岁，均符合2005年中国高血压指南中关于高血压的诊断标准，并排除继发性高血压。由于肾脏功能受累会导致患者血浆TRP浓度降低和KYN、KYNA浓度增高［2］，因此本研究对象还按2004年美国肾脏病基金会制定的慢性肾脏病(CKD)临床实践指南排除了所有CKD患者。

二、血浆TRP、KYN和KYNA浓度测定

1．样本采集及处理 早晨空腹取静脉血，肝素钠抗凝。1 800×g离心5min，取上清血浆置于－20℃储藏。待测血浆于测定当天临用前溶解，取150μL于0．5 mL塑料离心管中，加入等量0．6 mol/L高氯酸振荡充分混合，4℃ 8 000×g离心5 min，取上清液150μL置于样品瓶中的微量样品管中，盖紧密闭待测。

2．测定方法 参照先前建立的同时测定血浆TRP、KYN 和 KYNA 浓度的 HPLC［6］。仪器为安捷伦1100液相色谱仪［带有可变波长紫外可见检测器(VWD)和荧光检测器(FLD)］。VWD和FLD由1根长15 cm、内径为0．18 mm的 PEEK管相连。分析柱为安捷伦HC C18(2)反相色谱柱。流动相由20 mmol/L乙酸钠、3 mmol/L乙酸锌和7%乙腈组成，用前0．45μm滤膜过滤，超声波脱气15 min，等度洗脱，流速1．0 mL/min。进样量100μL，柱温为室温。VWD波长365 nm;FLD激发波长344 nm，发射波长398 nm。分析时间40 min。用标准加入法峰面积积分计算结果，数据处理由HP Chemstation色谱工作站完成。TRP、KYN和 KYNA标准品贮备液浓度为1 mmol/L，乙腈为美国TEDIA公司产品(HPLC/SPECTRO)，其余为国产分析纯试剂。试验用水为石英双蒸水。

3．IDO和KAT活性 以产物/底物的百分数表示，即IDO活性=KYN/TRP×100%;KAT活性=KYNA/KYN×100%。

三、统计学方法

统计分析由 GraphPad Prism 4．00和 SPSS 13．0软件完成。测定结果以¯x±s表示，两组间比较采用t检验，采用线性回归进行相关性分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、EH组和对照组TRP、KYN、KYNA浓度及IDO、KAT活性比较

EH组血浆TRP、KYN浓度及IDO、KAT活性与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0．05、P＜0．001)。KYNA浓度2组间差异无统计学意义(P ＞0．05)。见表1。

二、血浆TRP及其代谢产物浓度与年龄的相关性分析

EH组血浆TRP浓度与年龄呈负相关，而对照组二者之间无相关性。EH组和对照组血浆IDO活性均与年龄呈正相关，血浆KYN、KYNA浓度及KAT活性与年龄均无相关性。见表2。

表1 EH组和对照组血浆TRP、KYN、KYNA浓度及IDO、KAT活性比较(¯x±s)

表2 血浆TRP、KYN、KYNA浓度及IDO、KAT活性与年龄的相关性分析

讨 论

本研究发现，与对照组比较，EH患者血浆TRP浓度显著增高而KYN浓度显著降低，采用SPSS统计软件对年龄进行校正后统计结果依旧，提示外周IDO活性下降。这支持外周TRP和KYN对血压具有调节作用的动物实验结果［2-3］，TRP的增加能促使血压升高，但这种作用受到TRP剂量的影响，TRP剂量增加到某一阈值时反而会促使血压下降，其原因可能是高剂量TRP通过5-HT代谢途径产生大量5-HT引起血压下降［7］。高剂量TRP还通过KYN代谢途径产生大量KYN，而最新研究结果表明KYN是一种血管内皮舒张因子，能通过腺嘌呤和鸟苷酸环化酶途径减少血管的收缩并舒张血管［3］。IDO催化反应的底物TRP和产物KYN都参与了血压的调节，IDO基因的缺失或酶活性的下降都可能促进血压的增加。

无论是对照组还是EH组，血浆IDO活性均与年龄呈正相关，这反映了IDO在某种程度上与生理性衰老有关。而衰老对于心血管系统有着广泛负面影响，尤其是在高血压的血管病变中，随着年龄的增加，动脉硬化的情况日趋严重。Pertovaara等［8］在研究中发现IDO不仅与年龄呈正相关，还与颈动脉内膜-中膜厚度(IMT)呈正相关，而IMT正是早期动脉硬化的替代标志，能预测人群心血管事件的发生。IDO是否存在缓解动脉硬化的作用尚需更多的试验证明。

KYNA可能与血压的中枢调节有关［4］，由于KYNA经浓度扩散通过血脑屏障的量很小，外周KYNA浓度并不能代表其在中枢的浓度。本研究结果显示血浆KYNA浓度2组间差异并无统计学意义，EH组KAT活性的相对增加是由KYN降低造成的。通常在酶活性保持不变的情况下，底物浓度的降低会引起产物浓度的相应降低，但EH组血浆KYNA浓度与对照组相比未发生明显变化，可能与人体KAT活性代偿性增强有关，以维持对KYNA的正常生理需要。

本研究评估了 EH患者血浆 TRP、KYN、KYNA浓度和IDO、KAT活性，发现EH患者的血浆TRP浓度显著增加而KYN浓度显著降低，表明EH患者外周IDO活性显著低于对照人群，提示由IDO参与的TRP代谢可能参与了EH的发生和发展，具体作用机制仍有待于更深入的研究。

致谢:陈波、袁斐斐2位同志在试验样本收集方面给予了支持，在此谨致谢意。

［1］Schefold JC，Zeden JP，Fotopoulou C，etal．Increased indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)activity and elevated serum levels of tryptophan catabolites in patients with chronic kidney disease:a possible link between chronic inflammation and uraemic symptoms ［J］．Nephrol Dial Transplant，2009，24(6):1901-1908．

［2］WolfWA，Kuhn DM．Effects of L-tryptophan on blood pressure in normotensive and hypertensive rats［J］．J Pharmacol Exp Ther，1984，230(2):324-329．

［3］Wang Y，Liu H，McKenzie G，et al．Kynurenine is an endothelium-derived relaxing factor produced during inflammation［J］．NatMed，2010，16(3):279-285．

［4］Kwok JB，Kapoor R，Gotoda T，et al．A missense mutation in kynurenine aminotransferase-1 in spontaneously hypertensive rats［J］．JBiol Chem，2002，277(39):35779-35782．

［5］李宁宁，肖 冰，张 怡，等．犬尿氨酸氨基转移酶和犬尿喹啉酸在自发性高血压大鼠中的变化［J］．中华高血压杂志，2008，16(7):625-628．

［6］Zhao J，Gao P，Zhu D．Optimization of Zn2+-containing mobile phase for simultaneous determination of kynurenine，kynurenic acid and tryptophan in human plasma by high performance liquid chromatography［J］．JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2010，878(5-6):603-608．

［7］Diaz J，NiW，Thompson J，et al．5-Hydroxytryptamine lowers blood pressure in normotensive and hypertensive rats［J］．JPharmacol Exp Ther，2008，325(3):1031-1038．

［8］Pertovaara M，Raitala A，Juonala M，et al．Indoleamine 2，3-dioxygenase enzyme activity correlates with risk factors for atherosclerosis:the cardiovascular risk in young finns study ［J］．Clin Exp Immunol，2007，148(1):106-111．

Changes of plasma concentrations of tryptophan，kynurenine and kynurenic acid in essential hypertensive patients

XU Bingxin，ZHAN Yiming，GAO Pingjin，ZHU Dingliang，ZHAO Jianxing． (Shanghai Institute of

Hypertension，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai200025，China)

Objective To investigate the correlations between the pathogenesis of essential hypertension(EH)with peripheral indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)and kynurenine aminotransferase(KAT)activities by measuring plasma concentrations of tryptophan(TRP)，kynurenine(KYN)and kynurenic acid(KYNA)．M ethods TRP，KYN and KYNA weremeasured by high performance liquid chromatography(HPLC)in the plasma of 100 patients with EH and 80 healthy controls．The enzyme activity was estimated by calculating the percentage of product/substrate，as IDO activity=KYN/TRP×100%and KAT activity=KYNA/KYN ×100%．Results TRP concentrations were(59．85±9．89)μmol/L，which were significantly higher in patientswith EH than in healthy controls［(48．19 ±7．72)μmol/L，P ＜0．001］．KYN concentrations were(2．01 ±0．48)μmol/L，which were significantly lower in patientswith EH than in healthy controls［(2．17 ±0．43)μmol/L，P ＜ 0．05］．The concentrations of KYNA in the patients with EH were(24．10 ± 9．12)μmol/L，and were(23．59 ± 7．27)μmol/L in healthy controls，and there were no statistical significances between the 2 groups(P ＞0．05)．The IDO activity was 3．40% ±0．85%，which was significantly lower in the patientswith EH than in healthy controls(4．54% ±0．81%，P ＜0．001)．KAT activity(1．20% ±0．36%)in patients with EH was significantly higher than that in healthy controls(1．09% ±0．27%，P ＜ 0．05)．Plasma TRP concentration in the patients with EH had negative correlation with age(r= － 0．316，P=0．001)，and there was no correlation in the healthy controls(r= － 0．208，P=0．064)．Plasma IDO activity in the patients with EH and the healthy controls had positive correlation with age(EH group:r=0．264，P=0．008;control group:r=0．305，P=0．006)．There was no obvious correlation with age between the2 groups．Conclusions The increased concentrations of TRP and decreased concentrations of KYN in plasma of EH patients suggest that peripheral IDO activity in the TRP-KYN metabolism pathwaymay be involved in the pathogenesis of EH．

Tryptophan;Kynurenine;Kynurenic acid;Indoleamine 2，3-dioxygenase;Kynurenine aminotransferase;Essential hypertension

2011-08-30)

(本文编辑:龚晓霖)

1673-8640(2012)08-0624-04

R446．1

A

上海市卫生局科研项目(2009206)

徐冰馨，女，1986年生，硕士，主要从事原发性高血压发病机制研究。

赵建幸，联系电话:021-64740165。