类风湿性关节炎患者早期外周血单个核细胞Toll样受体2、4表达及意义

钱 雷， 汪晓莺， 吕丽君， 陈德训

(1．滨海县人民医院检验科，江苏滨海 224500;2．南通大学免疫学教研室，江苏南通 226001)

类风湿性关节炎患者早期外周血
单个核细胞Toll样受体2、4表达及意义

钱 雷1， 汪晓莺2， 吕丽君2， 陈德训1

(1．滨海县人民医院检验科，江苏滨海 224500;2．南通大学免疫学教研室，江苏南通 226001)

目的 探讨类风湿性关节炎(RA)早期患者外周血单个核细胞(PBMC)Toll样受体(TLR)2、TLR4对其配体双糖链蛋白多糖(BGN)、脂多糖(LPS)的刺激反应性，阐明PBMC TLR2、TLR4在RA疾病早期中的作用。方法 采用流式细胞术、实时荧光定量逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测BGN和LPS刺激前后，RA组和健康对照组外周血CD14+单核细胞TLR4+细胞频率、PBMC TLR2mRNA和TLR4 mRNA及上清液白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量变化。结果 RA早期患者TLR2 mRNA明显升高、TLR4 mRNA下降(P＜0．01);经LPS刺激后，RA患者TLR4 mRNA升高3．50倍，而健康对照组下降到0．11倍;LPS和BGN促进了各组PBMC产生IL-6、TNFα，但RA早期患者组上升的倍数明显高于健康对照组。结论 PBMC TLR2、TLR4参与早期RA的发生、发展。

Toll样受体2;Toll样受体4;外周血单个核细胞;类风湿性关节炎

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是生物的一种模式识别受体，其主要通过识别并结合病原体相关分子模式来启动免疫反应。到目前为止，在人体内至少有11种TLR相继被鉴定。有研究发现，TLR2、TLR4与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)有重要的关系。在RA患者滑膜成纤维细胞中，可检测到TLR2、TLR4、TLR3和TLR7［1］;RA关节腔滑液中巨噬细胞与正常巨噬细胞相比，高表达TLR2和TLR4［2］。但外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)TLR2、TLR4对早期RA的影响少见报道，本研究通过检测 RA早期患者 PBMC TLR2、TLR4，并观察对其各自特异性配体双糖链蛋白多糖(BGN)、脂多糖(LPS)的刺激反应性，阐明PBMC TLR2、TLR4在早期RA疾病中的作用。

材料和方法

一、研究对象

选取2010年9月至2011年3月在南通大学附属医院门诊部就诊的RA早期诊断患者20例，符合2009年美国风湿病学会和欧洲抗风湿联盟联合推出的RA诊断标准，均处于亚急性活动期，RA活动度评分(DAS-28)均在2．6～5．1之间。用药前采集标本。健康对照者20名，无相关自身免疫性疾病、肿瘤或近期感染史。各组间性别、年龄比较差异无统计学意义(P＞0．05)，见表1。

表1 RA早期患者和健康对照者临床资料

二、主要试剂和仪器

抗人 TLR4抗体、抗 TLR2抗体、藻红蛋白(PE)-鼠抗人TLR4抗体购自eBioscience公司，异硫氰酸荧光素(FITC)-鼠抗人CD14、逆转录(RT)试剂盒为Invitrogen产品，RPMI 1640培养基溶液购自Gibco公司，聚合酶链反应(PCR)引物由上海生物工程公司合成，SYBR GreenⅠ购自上海闪晶分子生物科技公司，LPS、BGN购自 Sigma公司，白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Bender MedSystems公司，荧光定量PCR仪为Corbett RG-3000。

三、方法

1．LPS、BGN刺激单个核细胞 Ficoll-Histopaque液分离10 mL肝素抗凝静脉血PBMC，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，860×g离心7 min，去上清，用RPMI 1640完全培养基(10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)重悬，分组种于24孔培养板，细胞浓度为1×106个/mL，加入不同浓度LPS、BGN(抗人TLR抗体孔在加入刺激剂前将体积为100μL细胞与5μL抗体先共育30 min)，置于 37℃ 5%CO2温箱培养 48 h，ELISA检测上清液细胞因子IL-6、TNFα浓度;收集细胞，PBS洗涤后，检测 TLR2 mRNA、TLR4 mRNA，流式细胞术检测CD14+单核细胞TLR4+细胞频率。

2．实时荧光定量RT-PCR检测单个核细胞TLRmRNA Trizol提取细胞总RNA，按RT试剂盒操作说明合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR检测。TLR2引物序列，上游:5'-GGAAGAATCCTCCAATCAGGC-3'，下游 5'-CTTCTGTGAGCCCTGAGGGA-3';TLR4引物序列，上游:5'-GAACCTGGACCTGAGCTTTAATC-3'、下 游 5'-AGATTGGATAAGATTGTGAGCCAC-3'，内对照 GAPDH引物序列:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'、下 游 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'。实时荧光定量RT-PCR采用25μL反应体系:2μL cDNA、12．5 μL 2 × SYBR Green Supermix、200 nmol/L上下游引物各1 μL、ddH2O 8．5 μL，按95 ℃ 7 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，45个循环，循环结束后做熔解度分析。

3．流式细胞仪检测CD14+单核细胞TLR4+细胞频率 取2×105PBMC，加入100μL PBS，与5 μL PE-鼠抗人 TLR4、5 μL FITC-鼠抗人 CD14室温避光温育30 min，PBS洗涤后，用200μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测TLR4+CD14+细胞占CD14+细胞百分比。

四、统计学方法

应用Stata统计分析软件进行方差齐性、正态性检验、两组比较t检验，检验水准α设为0．05。

结 果

一、RA早期患者未经刺激PBMC TLR mRNA表达

用相对定量2－ΔΔCt法计算 TLR mRNA 含量，将一例正常对照设定为1，具体结果见表2。

表2 RA早期患者PBMC TLRmRNA

二、经 50 ng/mL LPS刺激的 PBMC TLR4 mRNA变化

用相对定量2－ΔΔCt法计算TLR4 mRNA变化，将其未刺激对照设定为1。RA组经50 ng/mL LPS刺激后，TLR4 mRNA升高3．50倍(中位数)，而健康对照组下降到0．11倍(中位数)。

三、经50 ng/mL LPS刺激的CD14+单核细胞TLR4+细胞频率的变化

RA早期患者CD14+单核细胞TLR4+细胞频率与健康对照组相比，差异无统计学意义(P＞0．05，数据未显示)。用LPS刺激单个核细胞，发现培养24 h后，RA患者和健康对照者CD14+单核细胞表面TLR4表达均下降，但RA患者下降更加显著，48 h RA患者TLR4表达上升，而健康对照组TLR4表达持续下降，见图1。

四、ELISA检测PBMC经LPS刺激48 h的上清液 IL-6、TNFα 浓度

经50 ng/mL LPS刺激后，上清液IL-6浓度RA组上升了38．90倍，健康对照组上升了10．20倍;TNFα浓度RA组上升了54．80倍，健康对照组上升了26．80倍。PBMC与抗TLR4预先共育后，IL-6、TNFα浓度变化不显著。见表3。

图1 经LPS刺激的CD14+单核细胞TLR4+细胞频率变化百分率

五、ELISA检测PBMC经1 ng/mL BGN刺激48 h的上清液IL-6、TNFα浓度。

经1 ng/mL BGN刺激后，上清液IL-6浓度RA组上升了2．65倍，健康对照组上升了1．39倍;TNFα浓度RA组上升了5．76倍，健康对照组上升了1．39倍。PBMC与抗TLR2预先共育后，IL-6、TNFα浓度均下降。见表4。

表3 LPS刺激PBMC前后上清液IL-6、TNFα浓度

表4 BGN刺激PBMC前后上清液IL-6、TNFα浓度

讨 论

RA是一种以慢性、对称性多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现的自身免疫炎性疾病。目前其病因及发病机制不明，但一般认为是溶血性链球菌或其他细菌代谢产物、慢病毒或支原体的持续感染引起遗传易感个体的自身免疫反应。

小鼠关节炎模型研究表明，起始阶段通过TLR2活化促进血管的发生，便于炎症细胞黏附与侵袭，导致关节软骨和骨组织的破坏［3］，在发病后期，TLR4增加金属蛋白酶介导的破坏作用和破骨细胞形成［4］，导致慢性破坏性关节炎［5］，并提示内源性TLR4配体在关节破坏阶段发挥重要作用。Iwahashi等［6］用流式细胞术证实，RA 患者CD16+单核细胞高表达TLR2。本研究用实时荧光RT-PCR检测RA早期患者PBMC TLR2 mRNA表达，也证实RA早期患者TLR2显著增加，提示在人的RA早期，可能也是主要通过TLR2发挥疾病的始动作用。

本研究发现RA早期患者TLR4 mRNA降低，并且PBMC在未刺激的情况下产生的细胞因子IL-6、TNFα 反而比健康对照组低，而 IL-6、TNFα的浓度与RA病情严重性密切相关。PBMC产生细胞因子低的原因可能是RA早期产生炎症因子功能较强的单核细胞向关节腔聚集引起炎症反应。尽管RA患者早期PBMC TLR4 mRNA表达下降，但RA患者的PBMC对LPS的刺激反应性与健康对照组显著不同，经LPS刺激后，RA患者TLR4 mRNA上升，而健康对照组显著下降，可能的机制是RA患者单个核细胞对配体耐受性较强。用流式细胞术证实，CD14+单核细胞在LPS刺激24 h后，细胞表面TLR4表达下降，但RA患者下降更加显著，在48 h RA组又上升到未刺激时的状态，而健康对照组则持续下降，说明RA患者随着TLR4 mRNA上升，细胞表面TLR4蛋白表达恢复。

Huang等［7］从RA患者关节滑液中分离的巨噬细胞与体内单核细胞诱导分化而来的巨噬细胞相比，对肽聚糖和LPS有更高的反应性。本研究用LPS、BGN刺激PBMC，都导致了 IL-6、TNFα 等炎性细胞因子的产生增加，但RA组上升的倍数明显高于健康对照组，说明RA患者PBMC处于活化状态。用抗体封闭单个核细胞相应的TLR后，可使细胞因子的产生大幅度下降。

业已证实，RA患者的关节中不仅存在着TLR2和TLR4识别的微生物来源的肽聚糖、双链RNA等外源性TLR配体，还存在内源性TLR配体，如热休克蛋白 96［8］、纤维蛋白原、透明质酸等［9］。这些证据表明RA早期阶段，TLR可能通过识别外源性、内源性配体激活PBMC、滑膜成纤维细胞和巨噬细胞，上调前炎性细胞因子、趋化因子、组织破坏酶的表达，从而导致关节炎的发生。Sacre等［10］应用药物选择性抑制TLR信号途径，能改善胶原诱导的鼠关节炎症状，也可以抑制炎性细胞因子在人RA组织中的产生。

本研究结果显示，RA早期患者PBMC TLR2表达增加、TLR4下降，TLR4对其配体刺激有较高的反应性，产生更多的细胞因子，说明RA患者PBMC处于活化状态，通过TLR受体启动机体的炎症反应，合成和释放炎症因子，最终导致关节组织和骨组织的破坏。细菌、病毒的感染通过单个核细胞TLR引起一系列炎症反应可能是RA诱发因素。因此探讨TLR对RA免疫学发病机制以及在此环节上寻求更有效的疾病干预靶点具有重要意义。

［1］Sorensen LK，Havemose-Poulsen A，Sonder SU．Blood cell gene expression profiling in subjects with aggressive periodontitis and chronic arthritis［J］．J Periodontol，2008，79(3):477-485．

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［7］Huang Q，Ma Y，Adebayo A，etal．Increasedmacrophage activation mediated through toll-like receptors in rheumatoid arthritis［J］．Arthritis Rheum，2007，56(7):2192-2201．

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Study on the expression and significance of Toll-like receptor 2 and 4 of peripheralblood mononuclear cells in patients w ith early-stage rheumatoid arthritis

QIAN Lei1，WANG Xiaoying2，LÜ Lijun2，CHEN Dexun1．(1．

Departmert of Clinical Laboratory，Binhai County People's Hospital，Jiangsu Binhai 224500，China;2．Department of Immunology，Nantong University，Jiangsu Nantong 226001，China)

Objective To investigate the effects of Toll-like receptor(TLR)2 and TLR4 of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in patients with early-stage rheumatoid arthritis(RA)and the responsiveness of TLR4 to lipopolysaccharide(LPS)and TLR2 to biglycan(BGN)．M ethods The expressions of TLR4+/CD14+monocytes，TLR2 mRNA，TLR4 mRNA and cytokines of interleukin-6(IL-6)and tumor necrosis factor alpha(TNFα)in supernatantswere analyzed by flow cytometry，real-time fluorescence quantitation reverse transcription(RT)-polymerase chain reaction(PCR)and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)respectively in PBMC before and after stimulation．Results The TLR2 mRNA in PBMC of RA patientswere significantly higher than those of healthy controls(P ＜0．01)．The TLR4 mRNA of RA patients were significantly lower than those of healthy control．LPS increased TLR4 mRNA of RA patients(3．50-fold)and decreased TLR4 mRNA of healthy controls(0．11-fold)．LPS and BGN increased cytokines'production in all groups，while the increased folds of IL-6 and TNFα in PBMC from RA patients were significantly higher than the cells from healthy controls．Conclusions TLR2 and TLR4 of PBMC display important roles in the development of early-stage RA．

Toll-like receptor 2;Toll-like receptor 4;Peripheral blood mononuclear cell;Rheumatoid arthritis

2011-06-05)

(本文编辑:姜 敏)

1673-8640(2012)08-0659-04

R446．62

A

江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)

钱 雷，男，1970年生，硕士，副主任技师，主要从事自身免疫性疾病研究。通讯作者:汪晓莺，联系电话:0515-84234889。