大孔树脂精制杭白菊总黄酮的上样条件研究

吴海霞

(宁波镇海龙赛医院，浙江宁波315200)

大孔树脂精制杭白菊总黄酮的上样条件研究

吴海霞

(宁波镇海龙赛医院，浙江宁波315200)

目的优选D-101大孔树脂精制杭白菊总黄酮工艺中的最佳上样条件。方法将影响树脂吸附性能的3个因素上样量、流速和pH设计成3因素3水平试验，采用L9(34)表正交试验，以树脂吸附总黄酮含量、乙醇洗脱总黄酮含量和固体总黄酮含量为评价指标，选择最佳条件。结果确定最佳上样条件为上样量20 mL、pH为5、流速2 BV/h。结论该最佳上样条件可应用于大孔树脂精制杭白菊总黄酮的上样条件研究。

杭白菊;总黄酮;正交试验法;上样条件;大孔树脂

杭白菊Chrysanthemum morifolium Ramat;是一种常用中药，产于浙江桐乡、海宁、嘉兴等地，为“浙八味”之一，具有散风清热、平肝明目的功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花［1］。还可抗氧化［2］、抗肿瘤［3］、抗艾滋病［4］、治疗心血管病［5-6］。杭白菊含有多种挥发油、黄酮(香叶木素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、香叶木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷、金合欢素-7-O-β-D葡萄糖苷［7］)、菊苷等成分。现代药理研究表明，杭白菊挥发油解热、总黄酮降压是其散风清热、平肝明目的药理学基础之一［8］。因此，挥发油和总黄酮是其发挥药效作用的主要有效成分。为了提高杭白菊总黄酮的提取率，笔者采用正交试验设计，以杭白菊总黄酮含量为评价指标，优选出杭白菊总黄酮的最佳上样条件。现报道如下。

1 仪器与试药

D-101大孔树脂(安徽三星树脂科技有限公司，批号为100807);BS110型万分之一天平(北京赛多利天平有限公司); SKS200H超声仪(华南超声设备厂);RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);UV-VIS 8500型紫外可见分光光度计(天津市拓普仪器有限公司)。菊花(浙江中医药大学中药饮片厂);芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 溶液制备

精密称取芦丁对照品15;3 mg，转入100 mL容量瓶中，用30%乙醇稀释定容至刻度，摇匀，即得0;153 0 mg/mL芦丁对照品溶液。取杭白菊30 g精密称定，置100 mL圆底烧瓶中。加入16倍量、90%的乙醇。回流提取4次，每次1;5 h。每次提取前冷浸30 min，最后合并滤液，即得样品溶液。

2．2 标准曲线制备

精密吸取芦丁对照品溶液1，3，5，7，9，11 mL，分别置25 mL容量瓶中，各加入30%乙醇至12;5 mL，加入0;7 mL NaNO2 (1∶20)，摇匀，放置5 min后加入0;7 mL Al(NO3)2(1∶10)，6 min后再加入5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，混匀，用30%乙醇稀释至刻度，混匀，以相应试剂作空白，10 min后于516 nm波长处测定吸光度，以质量浓度(C)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标进行线性回归，得回归方程A=8;840 9 C-0;001 3，r=0;999 8 (n=6)。

2．3 总黄酮测定

精密吸取样品溶液0;5 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸馏水至6 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀后放置6 min，加10% Al(NO3)2溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10%NaOH溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂作为空白，在516 nm波长处测定各溶液吸光度，由标准曲线计算出样品中总黄酮含量。精密吸取洗脱液10 mL于已恒重的烧杯内，蒸干，放入58℃恒温干燥箱内，烘干至恒重。计算固体总黄酮含量。

2．4 正交试验设计

选择样品上样量(因素A，mL)、pH(因素B)、洗脱流速(因素C，BV/h)3个因素，进行正交试验(表1)。以吸附率、洗脱率、总固物含量为考察指标进行考察。

表1 正交试验因素水平表

2．5 D－101树脂的吸附、洗脱试验

取10 mL选定树脂，加95%乙醇浸泡过夜，倾去乙醇，加蒸馏水20 mL，三角烧瓶外作标记，浸泡1 h，重复多次至基本无醇味。将处理过的树脂湿法上柱，原柱中有5 mL蒸馏水，注意不要搅拌，用吸管，动作轻，防止树脂变细。然后，放出蒸馏水至液面高出柱床1 mm，用蒸馏水再洗1 BV，摸索流速。按表1所示上样条件进行上样吸附，收集流出液。用蒸馏水洗脱至HCL-Mg反应阳性，再用40%乙醇进行洗脱至洗脱液无色，并收集洗脱液。利用紫外分光光度法测定流出液和洗脱液的吸光度，根据标准曲线计算出浓度。按吸附率=(C样品液-C流出液)/C样品液× 100%，洗脱率=C洗脱液×25/［(C样品液-C流出液)×25］×100%，计算结果。

2．6 正交试验设计与结果

杭白菊总黄酮提取正交试验中各因素和水平之间的9种组合方式及每组结果见表2，方差分析结果见表3、表4、表5。可见，从吸附率结果可知A1B1C3为最佳吸附条件，从洗脱率和总固物率可见A3B1C3为最佳条件。从各个方差分析发现，对吸附率而言，因素A并没有显著性差异，从表3中也可看出各个A值的K1，K2，K3之间相差不大，故最佳条件为A3B1C3。

表2 正交试验设计及结果

表3 吸附率方差分析结果

表4 洗脱率方差分析结果

表5 总固物方差分析结果

2．7 验证试验

根据正交试验设计结果，采用最佳上样条件，按2;5项下进行验证试验，重复3次，结果见表6。可见，RSD远小于3%，准确度很高。

表6 验证试验结果

3 讨论

根据正交试验设计发现，随着样品上样量的增加，树脂对样品的吸附率降低。在一定上样量条件下，吸附率随流速的增加而降低。样品溶液的pH对吸附也有较大影响，但无明显的规律性。结果表明，紫外-可见分光光度法测定杭白菊总黄酮的含量操作简便，结果准确可靠。最佳上样条件为A3B1C3，即上样量20 mL、pH=5、流速2 BV/h。从洗脱率的方差分析可知，各个因素对洗脱率并没有显著性的影响，可以推断这个指标的选择对试验结果没有意义，以后进一步研究杭白菊总黄酮时应考虑是否选更具代表性的指标。由验证试验结果可知，3次试验结果明显优于其他9组试验，说明该最佳上样条件稳定可行，可用于大孔树脂精制杭白菊总黄酮。

［1］国家药典委员会;中华人民共和国药典(一部)［M］;北京:中国医药科技出版社，2010:292;

［2］张尔贤，方黎，张捷，等;菊花提取物的抗氧化活性研究［J］;食品科学，2000，21(7):6 291;

［3］Wang HK，Xia Y，Yang ZY，et al;Recent advances in the discovery and evelop-ment of flavonoids and their analogues as antitumor and anti-HIV agents［J］;Adv Exp Med Bio，1998，439:191-225;

［4］Hu CQ，Chen K，Shi Q，et al;Anti-AIDS agents，10'acacetin-7-O-β-D-galactopy-ranoside，an anti-HIV principle from Chrysanthe-mum morifolium and a structure-activity correlation with some related flavoids［J］;J Nat Prod，1994，57(1):422-511;

［5］浙江医科大学生理学教研组;菊花制剂对冠脉作用的实验研究［J］;浙江医科大学学报，1978，7(4):52-58;

［6］杨学运，孙孔富，奚毓妹，等;中药杭白菊酚性部分的药理作用探讨［J］;浙江医科大学学报，1989，18(6):28-31;

［7］贾凌云，孙启时，黄顺旺;滁菊花中黄酮类化学成分的分离与鉴定［J］;中国药物化学杂志，2003，13(3):159-161;

［8］戴敏，刘青云，李道中，等;菊花解热、降压作用的物质基础研究［J］;中药材，2001，24(7):505-506;

Study on Sampling Conditions of Refining Chrysanthemum Total Flavonoids with Macroporous Resin

Wu Haixia
(Zhenhai District Longsai Hospital，Ningbo，Zhejiang，China315200)

ObjectiveTo optimize D-101 macroporous resin for obtaining the best sampling conditions to refine chrysanthemum total flavonoids;Methods3 factors influencing resin adsorption ability，the sample volume，flow rate and sample solution pH value，were designed to the 3 factors 3 levels test;Adopting the L9(34)table orthogonal experiment，the total flavonoid content by resin adsorption，total flavonoids content by ethanol eluting and solid total flavonoid content were used as the evaluation indexes for screening the best conditions;ResultsThe best optimum sampling conditions were A3B1C3，i;e;，the sample volume of 20 mL，pH 5 and thevelocity of 2 BV/h; ConclusionThe best sampling conditions can be used in the sampling condition study for refining chrysanthemum total flavonoids by macroporous resin;

chrysanthemum;total flavonoids;orthogonal test;sampling condition;macroporous resin

TQ461;R284．2;R284．1

A

1006-4931(2012)14-0067-03

2011-10-28)