微量细胞培养法在手足口病毒研究中的应用

范荣军 李晓鹏 梁 爽 梁 英 怀清杰 任莉娜

哈尔滨市疾病预防控制中心，黑龙江哈尔滨 150056

微量细胞培养法在手足口病毒研究中的应用

范荣军 李晓鹏 梁 爽 梁 英 怀清杰 任莉娜

哈尔滨市疾病预防控制中心，黑龙江哈尔滨 150056

目的 建立应用于手足口病毒分离和对手足口EV71病毒抑制药物筛选的微量细胞培养方法。 方法 比较微量细胞培养结合real-time PCR和直接应用real-time PCR两种方法检测手足口病毒的差别，并应用微量细胞培养采用细胞病变效应法和MTT分析法，观察利巴韦林对EV71病毒的抑制作用。 结果 经微量细胞培养后EV71、CA16阳性检出率为90%和80%，但PE阴性样本20%检测为EV71阳性；利巴韦林浓度为0.4、0.2、0.1 mg/mL时对EV71病毒有抑制作用，抑制率分别为30.28%、28.09%和29.16%。 结论 微量细胞培养在手足口病毒分离检测和对其抑制作用药物筛选研究中具有可行性，且其具有操作简便、省时省力等优点。

微量细胞培养；手足口；病毒分离；药物筛选

手足口病是由多种肠道病毒引起的肠道传染病，最常见的为EV71型和COXA16 型，多发于5岁以下儿童，每年3～7月为发病高峰[1]。患儿和隐性感染者均为传染源，主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播，主要症状表现为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹。重症病例可出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿、循环障碍等，多由EV71感染引起[2]。本研究对微量细胞培养法检测手足口病毒及对手足口EV71病毒的抑制药物筛选方法的建立介绍如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

核酸提取仪（德国QIAGEN公司，QIAcube型），荧光定量PCR仪（美国ABI公司，7500 型），CO2培养箱（日本SANYO公司，MCO-15A型），倒置显微镜（日本Nikon公司，TE2000-5型），酶标仪（美国BIO-RAD公司，MODEL680型）。

1.2 试剂

核酸提取试剂盒（德国Qiagen公司，批号：139287329），MEM（美国Gibco公司，批号：1280330），胎牛血清（美国Hyclone公司，批号：NWCO389），EDTA-胰酶（美国 Gibco公司，批号：833117），利巴韦林注射液（山东华鲁制药有限公司，批号：D11112409），PBS（美国 Gibco公司，批号：615079），二甲基亚砜（美国Sigma公司，批号：D5879），MTT（美国Amresco公司，批号：0793），手足口real-time PCR检测试剂盒（江苏硕世生物科技有限公司 20110902）。

2 方法

2.1 微量细胞培养法在手足口病毒检测中的应用

2.1.1 标本的选择 选择本实验室2011年采集置- 70℃保存的咽拭子，经real-time PCR方法检测，EV71阳性样本10份，CA16阳性样本10份，PE阴性样本10份。

2.1.2 微量细胞准备 用人喉癌上皮细胞（Hep Ⅱ细胞）经EDTA-胰酶消化后按（2～5）×106个/mL细胞密度传代接种于无菌的96孔微量细胞板，每孔100 μL， 置36℃含5%CO2培养箱中，2 d后细胞即可长成单层即可用。

2.1.3 病毒分离[3-4]将准备好的细胞弃去培养液，用不含小牛血清的病毒培养液洗2 次， 每份标本接4孔，50 μL/孔，预留4孔作细胞对照。置34℃含5%CO2培养箱吸附2 h，吸弃标本液，再用不含小牛血清的病毒培养液洗1次， 每孔加200 μL病毒培养液，置34℃含5% CO2培养箱，连续每天倒置显微镜下观察细胞病变，采用细胞病变效应（CPE）法。

2.1.4 结果检测 小心吸取合并病变的相同样本孔内培养上清液，用real-time PCR法检测上清培养液。

2.2 微量细胞培养法筛选对EV71病毒抑制药物方法的建立

2.2.1 病毒增殖[3]将EV71病毒接种于单层Hep Ⅱ细胞上，加病毒培养液置34℃含5% CO2培养箱培养3 d后出现90%以上的病变，冻融3次后吹打离心，定量分装，置-80℃冰箱冻存备用。

2.2.2 病毒感染性的测定[5]将EV71病毒液10倍递次稀释成1×10-1～1×10-88个浓度，用病毒液接种培养板，每个稀释度设10孔，同时设不加病毒液的正常细胞对照培养。每日在倒置显微镜下观察细胞病变，CPE记录方法为：无CPE为“-”，25%以下细胞病变为“+”，25%～50%细胞病变为“++”，＞50%～75%细胞病变为“+++”，＞75%～100%的细胞病变为“++++”。用Reed-Muench公式计算病毒液的TCID50。

2.2.3 利巴韦林细胞毒性检测 将利巴韦林注射液用细胞培养液 1∶ 1、1∶ 2、1∶ 4、1∶ 8、1∶ 16稀释，接种于准备好的细胞上，每个稀释度设4孔，同时设不加药液的正常细胞对照培养，每日观察细胞病变，连续7 d观察药物毒性，细胞出现病变者判为药物毒性，并根据Reed-Muench公式计算利巴韦林注射液对Hep Ⅱ细胞的毒性。

2.2.4 利巴韦林对EV71病毒的作用 取准备好的细胞，弃去培养液，用不含小牛血清的病毒培养液洗2次，每孔接种100TCID50的病毒液，预留4孔作细胞对照，置34℃含5% CO2培养箱吸附2 h，吸弃病毒液，再用不含小牛血清的病毒培养液洗1次，每孔加100 μL起始浓度为0.4 mg/mL的利巴韦林药液，并对倍稀释，连续10个稀释度，每个稀释度设4孔，设病毒对照4孔，置34℃含5%CO2培养箱，连续每天倒置显微镜下观察细胞病变。当病毒对照出现75%以上细胞病变时，吸弃孔内液体，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4）20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃并合并相同样本孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分融解。酶标仪上490 nm处测定OD值[6]。并根据公式计算利巴韦林注射液对EV71病毒的抑制率。病毒抑制率=（试验组平均OD值-病毒对照组平均OD值）/（细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值）×100%。

3 结果

3.1 微量细胞培养-real-time PCR法与real-time PCR法结果比较（表1）

由表1可见，real-time PCR法直接检测的1份EV71样本和2份CA16样本未引起Hep Ⅱ细胞发生病变，而2份阴性样本经Hep Ⅱ细胞培养增殖后经real-time PCR法检测为EV71阳性。

表1 微量细胞培养-real-time PCR法与real-time PCR法结果

3.2 利巴韦林对EV71病毒的抑制作用

3.2.1 EV71病毒感染性的测定 根据在倒置显微镜下连续观察细胞病变，Reed-Muench法计算TCID50。TCID50=Antilog[CPE＞50%病毒稀释度+（＞50%的百分数-50）/（＞50%的百分数-＜50%的百分数）×lg10]计算结果本次实验的所得到的EV71病毒液的TCID50为：2.43×10-6/0.1 mL。

3.2.2 利巴韦林细胞毒性检测结果 利巴韦林对Hep Ⅱ细胞的的半数毒性浓度（TC50）为1.49 mg/mL。浓度为0.4 mg/mL的利巴韦林处理Hep Ⅱ细胞时，CPE观察无细胞病变，MTT法分析细胞存活率为83.8%。因此以0.4 mg/mL作为利巴韦林抗EV71病毒活性检测的起始浓度。

3.2.3 利巴韦林抗EV71病毒活性 CPE观察法和MTT分析法检测利巴韦林抗EV71病毒的抑制效率，利巴韦林浓度为0.4、0.2、0.1 mg/mL时对EV71病毒的抑制率分别为30.28%、28.09%和29.16%，当利巴韦林浓度为0.05 mg/mL及以下时则对EV71病毒无明显抑制作用。见表2。

4 讨论

经微量细胞培养后EV71、CA16阳性检出率分别为90%和80%，可能是由于细胞对病毒的敏感度不同，使得有些病毒未增殖成功，如果使用两种细胞系可能会得到较好的结果；而PE阴性样本20%检测为EV71阳性，是由于经细胞培养是一个病毒扩增、增毒的过程，从而增加了real-time PCR的检出率[7]。病毒分离培养对流行病学分析具有重要意义，但由于病毒培养耗时，往往贻误特异性治疗，使得其对临床诊断具有一定的限制性[8]。因此，在具体检验工作中，我们应根据工作需要选择合适的检验方法。

在实验选取的利巴韦林浓度为0.4～0.1 mg/mL时对EV71有抑制作用，3个浓度的抑制效果差异不显著。在以往的抗病毒研究中，用光镜观察CPE是常用的方法，但这种方法比较繁琐，划分等级粗糙，而且需要一定的经验。而MTT法作为一种抗病毒活性的评价方法具有快速、简便、敏感、高效等特点，能在较短的时间内对大量的药物进行筛选和评价，省去了繁琐的实验程序，而且取得的数据客观可靠，是较为理想的实验方法[9]。

表2 利巴韦林抗EV71病毒活性结果

微量细胞培养在手足口病毒分离检测和对其抑制作用药物筛选研究中具有可行性，且其具有操作简便、省时省力等优点。在应用此法的过程中，笔者认为控制标本间的交叉污染是整个实验成败的关键。

[1] 郭照江，王宪斌，温红伟.利巴韦林气雾剂对手足口病应急预防应用研究[J].中国医药科学，2012，2（3）：113-114.

[2] 尹胜平，蒋茵，覃平，等.重症手足口病52例治疗总结[J].中国医药科学，2012，2（3）：15-18.

[3] 卫生部.手足口病预防控制指南[M].北京：卫生部，2009：1.

[4] 狄飚，伍颂民，周秀珍，等.微量细胞培养法在分离流感病毒中的应用[J].疾病监测，2001，16（1）：5-6.

[5] 张正军，肖敏.痰热清抗呼吸道合胞病毒作用体外实验研究[J].医药论坛杂志，2011，32（5）：23-26.

[6] 徐春华.MTT法检测大豆异黄酮对癌细胞的生长抑制作用[J].中央民族大学学报（自然科学版），2012，21（1）：58-62.

[7] 梁英，怀清杰，张炳丽，等.两种检测方法对EV71病毒监测结果的影响研究 [J].中国卫生检验杂志，2010，20（7）：1590-1592.

[8] 田燕，陆志刚，梁洁.手足口病检测方法的研究进展[J].现代预防医学，2011，38（15）：3058-3060.

[9] 刘钊，杨占秋，肖红，等.MTT法在抗病毒药物筛选中的应用[J].武汉大学学报（医学版），2004，25（3）：332-335.

The application of trace cell culture method in the EV71 virus research

FAN Rongjun LI Xiaopeng LIANG Shuang LIANG Ying HUAI Qingjie REN Lina
Harbin Center for Disease Control and Prevention,Harbin 150056,China

ObjectiveTo construct a trace cell culture method for isolating the hand-foot-and-mouth virus and screening drugs to inhibit the EV71 virus.MethodsThe differences of EV71 virus detection using a combination of trace cell culture and real-time PCR or single real-time PCR were studied, and inhibition effects of ribavirin against EV71 were investigated through the trace cell culture using cytopathic effect and MTT analysis.ResultsThrough the trace cell culture, EV71 and CA-16 positive detection ratio values were 90% and 80%, respectively; and the EV71-positive value was 20% in PE negative samples. With the ribavirin concentration of 0.4,0.2,0.1 mg/mL,the inhibition ratio values against EV71 virus were 30.28%,28.09% and 29.61%, respectively.ConclusionThe trace cell culture method is feasible for the isolating and detecting the hand-foot-and-mouth virus, and also the screening of inhibition drugs. Meanwhile, this method is more simple, convenient and time-saving.

Trace cell culture;Hand-foot-and-mouth disease;Virus isolation;Drug screening

R183.4

A

2095-0616（2012）11-14-03

黑龙江省哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目（2009RFQQS007）。

2012-05-02）