云龙黑木耳中多糖的提取与测定

倪兆林，申元英，，白 丽，陈红云，2，李润兵

（1.大理学院公共卫生学院，云南大理 671000；2.大理学院基础医学院，云南大理 671000）

云龙黑木耳中多糖的提取与测定

倪兆林1，申元英1，2*，白 丽2*，陈红云1，2，李润兵1

（1.大理学院公共卫生学院，云南大理 671000；2.大理学院基础医学院，云南大理 671000）

目的：提取云龙野生和人工培养两种黑木耳多糖并测定其含量。方法：采用乙醇浸提法提取多糖，紫外分光光度苯酚-硫酸显色法测定粗多糖含量。结果：在8.0～48.0 μg/mL线性范围内，回收率为99.03%，RSD为0.66%（n=6），测到野生和人工培养黑木耳中多糖的收率分别为18.48%和18.29%；野生和人工培养黑木耳中多糖的含量分别为9.21%和8.20%。结论：野生黑木耳比人工培养黑木耳中多糖的含量高，生长环境对黑木耳多糖含量有影响。

黑木耳；乙醇浸提法；紫外分光光度苯酚-硫酸显色法；多糖；含量

黑木耳（Auricularia auricular）属大型真菌，味干、平、无毒，具有益气润肺、凉血、止痛、补血、舒筋活络等功效，是优良的食用菌和药用菌〔1〕。云龙黑木耳具有瓣大、朵型好、肉厚细嫩、色泽乌黑透亮、富有弹性、味道鲜美等特点，被誉为山珍中的“素中之荤”。木耳多糖可降低血脂、胆固醇和血糖含量，具有抗炎、抗肿瘤、抗凝血、抗动脉粥样硬化、抗放射、抗血栓形成等作用〔2-4〕，还可增强人体超氧化物歧化酶（SOD）活力，减少自由基产生，提高免疫力，改善心肌缺氧。文献〔10-11〕报道野生黑木耳的多糖含量比栽培黑木耳高2.69%。本文以云南省大理州云龙县产的野生黑木耳和人工栽培黑木耳为材料，采用乙醇浸提法〔1，5-6〕提取多糖，紫外分光光度苯酚-硫酸显色法测定粗多糖含量，旨在了解野生与人工栽培黑木耳之间的多糖含量区别，验证前人结论。

1 试验材料

1.1 样品 野生黑木耳和人工培养黑木耳鲜品购于云南省大理州云龙县市场，自然晾晒干燥备用。

1.2 试剂 石油醚、乙醇、氯仿、丙酮、浓硫酸（AR，天津市化学试剂三厂）；无水葡萄糖标准品（AR，上海试剂厂）。

1.3 仪器设备 UV-T6紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；AL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器公司）；GZX-9240 MBE型数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；电子恒温水浴锅（上海金桥科析仪器厂）。

2 实验方法

2.1 多糖的提取 准确称取10份干燥的黑木耳各10.00 g，分别经石油醚60 mL于60℃回流脱脂2 h。倾去石油醚，剩余物挥干溶剂后分别用80%乙醇60 mL浸泡3 h，于80℃加热1 h，过滤。将固体物分别用蒸馏水300 mL浸泡过夜，然后于90℃水中温浸提取1 h，再用蒸馏水100 mL，于90℃重复温浸提取30 min。过滤，合并滤液，减压浓缩至30 mL，用氯仿萃取3次，以除去蛋白质。过滤后，滤液加入95%乙醇使乙醇含量达80%，静置过夜，多糖沉淀，过滤。滤饼依次用无水乙醇、丙酮、乙醚4次洗涤，干燥。

2.2 标准曲线的绘制

2.2.1 葡萄糖标准液的配制 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品10.000 0 mg，置250 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，即可得到浓度为0.04 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

2.2.2 苯酚试液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.2 g、碳酸氢钠0.1 g，蒸馏收集182℃的馏份，称取此馏份10 g置棕色瓶中，加水150 mL，摇匀，备用。

2.2.3 标准曲线的制备 分别吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL的0.04 mg/mL的葡萄糖标准溶液置于7个具塞试管中，分别加蒸馏水2.00、1.80、1.60、1.40、1.20、1.00、0.80 mL，使总体积为2.0 mL。再分别加苯酚试液1 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，迅速摇匀，静置10 min，置沸水浴中加热15 min后取出用冷水迅速冷却至室温。最后以第1管中未加入葡萄糖的作为空白对照。用紫外分光光度计于490 nm〔7〕的波长处检测其吸光度。

2.3 样品多糖含量的测定 精密称取粗黑木耳多糖样品粉末各0.300 0 g，置于烧瓶中，加80%乙醇100 mL，90℃回流提取1 h，趁热过滤，滤饼用80%热乙醇洗涤（10 mL×3）。滤饼连同滤纸置于烧瓶中，加蒸馏水100 mL，加热至90℃提取2 h，趁热过滤，滤饼用热水洗涤（10 mL×3），洗液并入滤液，放冷后移入500 mL量瓶中，用蒸馏水定容成样品备用。量取上述2种待测样品溶液各0.50 mL，按上述标准曲线操作步骤和条件，测定吸光度。

3 结果与分析

试验数据应用统计软件SPSS17.0进行t检验分析。

3.1 黑木耳粗多糖及收率 样品提取后干燥计算得野生和人工培养黑木耳的粗多糖收率平均为18.50%和18.30%，野生黑木耳收率高于人工培养黑木耳。两种黑木耳的收率差异具有统计学意义（t= 5.586，P=0.005）。见表1。

表1 黑木耳粗多糖及收率

3.2 标准曲线回归方程建立 用紫外可见分光光度计，以未加入葡萄糖管作为空白对照，在490 nm的波长处测定吸光度，以吸光度值（A）对葡萄糖浓度C作回归处理，得线性范围为8.0～48.0 μg/mL，n=7的回归方程。见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

3.3 换算因子的测定 精确称取干操至恒重的精制黑木耳多糖4 mg，置于50 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀。吸取上述溶液100 μL，按上述标准曲线操作方法操作测定吸光度，求出此精制黑木耳多糖中葡萄糖的浓度，按下式计算出换算因子F，F=W/（C×D）。式中：W为多糖重量（mg）；C为精制多糖中葡萄糖的浓度（μg/mL）；D为多糖的稀释因素，经计算得F=1.59。

3.4 稳定性试验 取同一样液适量，按上述标准曲线操作方法，测定吸光度，每隔0.5 h测定1次吸光度，连续测定6次，见表2。测定结果表明苯酚-硫酸显色后，样品溶液在在3 h内基本稳定。

3.5 精密度试验 取同一样液适量，按上述标准曲线操作方法操作，重复测定吸光度5次。由实验数据计算〔8〕得相对标准偏差（RSD）为1.06%，小于5%，表明该方法精密度良好。

3.6 重复性实验 重复吸取来自同一批原料的试样，按上述标准曲线操作方法，分别测定其吸光度，检验该测定方法的重现性，由实验数据计算得RSD为0.95%，小于5%，表明该方法重复性较好。

3.7 回收率试验 取已提取的粗黑木耳多糖样品溶液1.5 mL于6只试管中，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的标准葡萄糖溶液，按上述标准曲线操作方法，分别测定其吸光度，计算回收率，见表3，样品回收率为99.83%，在97%～104%之间，RSD为0.96%小于5%，表明本法可行。

表3 回收率实验结果

3.8 野生及人工培养黑木耳多糖的含量 按上述多糖含量测定方法，经平行实验操作3次，用回归方程计算待测样品溶液中葡萄糖的浓度：多糖含量（%）=（C×D×F/W）×100%

式中C为供试液葡萄糖浓度（μg/mL），D为供试液的稀释因素，F为换算因子，W为供试品重量（μg），测定结果表明野生和人工培养黑木耳的粗多糖含量分别为9.21%和8.20%，野生黑木耳多糖含量高于人工培养黑木耳多糖含量。野生黑木耳与人工培养黑木耳多糖含量之间差异有统计学意义（t= 5.078，P=0.007），结果见表4。

表4 野生及人工培养黑木耳中多糖含量

4 讨论

目前，黑木耳的提取方法〔9〕有以下几种：热水浸提法，要求多次浸提，操作时间长，收率低；酸浸提法和碱浸提法，这两种方法易使部分多糖发生水解，破坏多糖的活性结构、减少多糖得率；酶价法，价格较高，使用的条件较为苛刻；超声提取法，具有时间短、效率高、提取量高，可防止提取物在长时间、高温条件下发生降解、褪色等变化；超声波协同纤维素酶提取法，可达到加快细胞壁释放多糖的速度，缩短提取时间、提高多糖提取率的目的；乙醇提取法，该方法简单，显色稳定，灵敏度高，重现性好，适宜黑木耳多糖的含量测定。所以本试验采用乙醇提取法。

据有关文献报道〔10〕野生黑木耳的蛋白质、脂肪、总糖、多糖含量分别比栽培黑木耳高0.70%、0.06%、1.40%、2.69%。本试验测得云龙县野生黑木耳和人工培养黑木耳中多糖的含量分别为9.21%和8.20%，两者之间差异有统计学意义（P＜0.05），与上述结论相符。

志谢 感谢苟高章，陆鸳妮，曹艳芬，刘加梅等同学的支持与协助!

〔1〕韩春然，马永强，唐娟.黑木耳多糖的提取及降血糖作用〔J〕.食品与生物技术学报，2006，25（5）:111-114.

〔2〕张润光，刁小琴，关海宁.黑木耳营养保健功能及其产品开发〔J〕.保鲜与加工，2010，1（10）:54-56.

〔3〕刘雅静，袁延强，刘秀河，等.黑木耳营养保健研究进展〔J〕.中国食物与营养，2010，10（7）:6-68.

〔4〕李志强，郑慧哲，刘鹤瑞，等.黑木耳多糖对兔动脉粥样硬化斑块中FAK表达的影响〔J〕.牡丹江医学院学报，2011，32（1）:1-3.

〔5〕黄贤刚，全永亮，管斌，等.黑木耳多糖研究进展〔J〕.粮油食品科技，2010，18（1）:46-49.

〔6〕王志刚，姜红，朱蓓薇.碱法提取木耳渣中多糖的研究〔J〕.大连轻工业学院学报，2007，26（3）:206-209.

〔7〕周玲，唐静，李娇，等.野生及人工培养香菇和黑木耳中粗多糖含量测定〔J〕.大理学院学报，2008，7（8）:58-60.

〔8〕张唐伟，李天才.苯酚-硫酸法测定西宁地区地木耳中多糖含量〔J〕.分析试验室，2010，29（5）:219-220.

〔8〕郭平，卢家炯，林海霞.黑木耳多糖功效与提取方法〔J〕.中国林副特产，2006（6）:72-74.

〔9〕张钟，高智谋，章战华，等.野生黑木耳多糖的提取及特性研究〔J〕.中国食用菌，2006（25）:178-179.

〔10〕史岳红，鲜乔，张拥军.不同品种黑木耳多糖含量差异的研究〔J〕.浙江食用菌，2009，17（5）:15-17.

Extraction and Determination of Polysaccharides from Yunlong Auricularia auricular

NI Zhaolin1,SHEN Yuanying1，2*，BAI Li2*,CHEN Hongyun1，2，LI Runbing1
（1.Collegle of Public Health,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.Pre-clinical Collegle,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To extract both artificial culture and wild Auricularia auricular polysaccharides and determinate their contents.Methods:The polysaccharide wasextracted with ethanoland the polysaccharide contentwaswired by UV spectrophotometry phenol-sulfuric acid color method.Results:Within the range of 8.0-48.0 μg/mL,the recovery ratio of polysaccharide was 99.03%with RDS of 0.66%（n=6）.The recovery ratio of polysaccharide in artificial culture and wild Auricularia auricular were 18.48%and 18.29%,respectively.Artificial culture and wild Auricularia auricular in the polysaccharide content was 9.21%and 8.20%,respectively.Conclusion:Wild Auricularia auricular has higher content of polysaccharides than that of culture artificially.Growing environment affects the contents of Auricularia auricula's polysaccharides.

Auricularia auricula;ethanol extraction;UV spectrophotometry phenol-sulfuric acid method;polysaccharides;content

R284.2［文献标志码］A［文章编号］1672-2345（2012）03-0031-04

大理学院大学生科研基金资助项目（2008DXS131）

2011-06-15

2011-07-23

倪兆林，主要从事流行病与卫生统计学研究.

*通信作者:申元英，教授；白丽，教授.

（责任编辑 毛本勇）