梯度温度法提高L-赖氨酸发酵水平的研究

廉少杰，张伟国

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)

梯度温度法提高L-赖氨酸发酵水平的研究

廉少杰，张伟国*

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)

对黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)XQ90发酵生产赖氨酸的条件进行了研究。结果表明:两阶段温度控制策略(0～18h 31℃，18h～结束34℃)更有利于提高产量和发酵强度;在控温的基础上发酵周期缩短至60h;同时通过连续流加葡萄糖和硫酸铵确定了最佳残糖维持浓度5～10g/L和最佳氨氮浓度1.0～2.0g/L;在最优条件下，赖氨酸盐酸盐的产量从111g/L提高到151g/L，糖酸转化率达50.2%。

黄色短杆菌，温度控制，流加发酵，残糖，氨氮

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)XQ90 江南大学生物工程学院代谢调控与代谢工程研究室保藏菌种;完全培养基(g/L) 葡萄糖5、牛肉膏10、蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 5、琼脂20;种子培养基(g/L)葡萄糖25、(NH4)2SO42、KH2PO420、MgSO4· 7H2O 0.4、玉米浆35、碳酸钙40;发酵培养基(g/L)葡萄糖80、(NH4)2SO48、KH2PO420、MgSO4.7H2O 0.8、MnSO4·4H2O 0.02、FeSO4·7H2O 0.02、VB110、VH50、玉米浆10、糖蜜12;以上培养基均以20% NaOH调pH至7.8，完全培养基和种子培养基121℃灭菌20min，发酵培养基115℃灭菌10min。

SBA－40C生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所;立式圆形压力蒸汽灭菌器 上海医用核子仪器有限公司;往复式摇床 无锡查桥轻机厂; UV－2100可见紫外分光光度计 上海尤尼克有限公司;超净工作台 苏净集团安泰公司;PHS－3C型精密pH计 上海雷磁仪器厂;5L发酵罐 高百特发酵机(上海)有限公司。

1.2 培养方法

1.2.1 种子培养 500mL三角瓶中装液量80mL，置于往复式摇床上90r/min，31℃振荡培养16h。

1.2.2 5L发酵罐发酵 发酵罐中装液量2L，流加浓氨水控制pH7.0～7.2，通过流加泡敌消泡，发酵过程中流加800g/L的糖溶液和500g/L的(NH4)2SO4，控制发酵罐体积2.5L左右，中间过程进行连续放料，进多少、排多少。

1.3 分析方法

1.3.1 pH测定 国产精密pH试纸和PHS－3C型精密pH计测定。

1.3.2 OD的测定 取发酵液稀释25倍后，在波长562nm下测量吸光度。

1.3.3 发酵液中还原糖、L－赖氨酸的测定 采用SBA－40C生物传感分析仪测定;氨氮的测定采用微量凯氏定氮装置。

1.3.4 菌体干重(DCW)的测定 取发酵液10mL于5000r/min离心分离10min，并用蒸馏水洗涤两次，然后置于105℃条件下干燥至恒重，从而得到菌体干重。

2 结果与讨论

2.1 温度对L－赖氨酸发酵的影响

微生物的生长和产物的合成均需在其各自适合的温度下进行。温度对微生物的生长、产物合成及代谢的影响是多方面的，不仅可以改变培养基的性质，而且会影响细胞代谢过程中各种关键酶的活性。温度对发酵的影响是各种因素综合变现的结果，因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境［5］。

从图1、图2可以看出，随着温度的升高赖氨酸产生菌进入生长稳定期的时间缩短，稳定期最大菌体量与最大比生长速率均出现在31℃时，故此温度是该菌株的最适生长温度。随着温度升高赖氨酸的合成速率在逐渐增加，但当超过34℃时，产物合成速率和产量明显降低，最大比生长速率降低，赖氨酸比生产速率也降低。在34℃时赖氨酸的平均比生产速率和平均比合成速率均最大，故此温度是该菌株的最适产酸温度。此菌株在此温度下生物量减少，产量增加说明了葡萄糖代谢中碳架流量分布发生了变化，在赖氨酸的代谢途径中某些酶的活性有变化，可能是柠檬酸合成酶的基因gltA活性降低和调节丙酮酸和NADPH的酶malE活性增加的原因［6－7］。在以上基础上提出两阶段温度控制策略，控制的指标主要是根据菌体浓度来调控，图4可以看出当菌体浓度在11.70g/L时产量和转化率都是最高，同时结合图3得最佳温度控制策略:0～18h 31℃，18h～最后34℃。同时温度升高后发酵时间也相应的缩短至60h。

2.2 最适残糖维持浓度的确定

微生物发酵的生产水平除取决于菌种本身的性能外，更加注重发酵条件的调控，以最少的原料和能源投入，获得最大产出［8］，尤其是残糖的控制。如果残糖浓度过高或过低，对菌体的生长，赖氨酸的产量和赖氨酸对糖的转化率均不利。

在恒速流加硫酸铵下，连续流加800g/L的糖溶液，使残糖的浓度维持在A:0～5g/L、B:5～10g/L、C: 10～15g/L和D:15～20g/L四个水平，比较其对产酸的影响。

图1 不同温度下赖氨酸发酵过程Fig.1 Lysine fermentation under different temperatures

图2 不同温度下赖氨酸发酵过程动力学参数的变化Fig.2 Kinetics parameters of lysine fermentation under different temperatures

图3 赖氨酸产生菌的生长曲线Fig.3 The growth curve of lysine strain

由图5可知当残糖浓度维持在5～10g/L时，产量最高。如果控制残糖浓度高于此浓度，按Monod方程，当营养物质浓度增加到一定量时，生长就显示饱和动力学，若继续增加底物浓度，就可能产生一种基质抑制区，停滞期延长，比生长速率减小，菌体浓度下降等，同时葡萄糖或是其分解代谢产物能够抑制多种酶或产物的合成［9］，从而引起代谢流量的变化;当低于此浓度时产酸下降，可能是发酵液中的碳源不足以维持细胞合成过量产物的需求。在12～18h内残糖影响不是很大，主要是培养基中8%的初糖没有完全消耗，在20h开始补糖后，不同浓度的残糖对产量的影响比较明显。

图4 不同菌体浓度对赖氨酸发酵控温的影响Fig.4 Lysine fermentation under bacteria concentraion

图5 不同残糖浓度对赖氨酸的影响Fig.5 Effect of residual glucose concentration on L－lysine acid fermentation

2.3 最佳氨氮浓度的确定

以硫酸铵作无机氮源，菌体生长和产酸远远优于其他无机氮源［10］，这主要是因为硫酸铵不但可供作氮源，而且NH+4与SO2－4可激活赖氨酸合成途径中的关键酶天冬氨酸激酶，有利于赖氨酸的合成［11］。研究渗透压对赖氨酸的影响时发现，在整个过程中维持硫酸铵2%时可增加发酵过程的氧供给［12］。在发酵过程中氨氮的来源除了硫酸铵还有就是调pH的氨水，不少文献都是以恒速流加硫酸铵为指标，没有直接以氨氮为指标控制更为精确。

在恒速流加葡萄糖的情况下，连续流加500g/L的硫酸铵，使氨氮的浓度控制在A:0～1g/L，B:1～2g/L，C:2～3g/L，D:3～4g/L四个水平，比较其对产量的影响。

由图6可知当氨氮浓度维持在1～2g/L内产量最大。细胞生长环境中过高的离子如NH+4会影响物质代谢特征、代谢过程中关键酶的活性和细胞中某些成分的生成［13］，从而影响菌体生长和赖氨酸的积累。在12～24h内产酸基本上没有大变化，主要是由于初始培养基中的硫酸铵，玉米浆提供的氮源足以维持前期细胞的生长和产酸;24h～最后通过流加的硫酸铵，中间根据pH变化自动补加氨水，调节所需的氨氮浓度，由图可知氨氮对赖氨酸产量的影响比残糖对赖氨酸的影响大。

2.4 发酵条件优化前后主要发酵参数的比较

图6 不同氨氮浓度对赖氨酸的影响Fig.6 Effect of ammomia nitrogen concentration on L－lysine acid fermentation

表1是在以上优化条件的基础上，发酵3次得到的平均数据。由此可见发酵条件优化效果。

表1 发酵条件优化前后主要发酵参数比较Table 1 Comparison of fermentation parametrers before and after optimization

3 结论

本文通过控制发酵过程中的温度，确定了最适生长温度和最适产酸温度分别是31℃、34℃，温度调控以菌体浓度为指标，发酵前期(0～18h)控制温度在31℃，此阶段主要是长菌，发酵中后期(18h～结束)升温至34℃，运用两阶段控温方法不仅使产量提高，而且缩短了发酵时间，提高了设备利用率。然后通过连续流加葡萄糖和硫酸铵，确定了最适残糖浓度和最适氨氮浓度，连续流加很好地解决了抑制性底物浓度对发酵的影响，解除或减弱分解代谢物的阻遏;同时菌体浓度也降低了，不仅有利于溶氧的调节，对后续提取工艺也有一定的帮助。在以上条件控制下发酵周期缩短了6h，产量提高了36.0%，糖酸转化率提高了24.5%，生产强度提高了20.4%。

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Study on the conditions of L－lysine acid production with gradient temperature fermentation

LIAN Shao－jie，ZHANG Wei－guo*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Fermentation conditions of Brevibacterium flavum XQ90 for lysine acid production were studied.It was found that the two－stage temperature strategy was better for fermentation(0～18h 31℃，18h～end 34℃)，and fermentation time was decreased to 60h in the new process.At the same time the optimal residual sugar concentration was 5～10g/L，and ammomia nitrogen was 1.0～2.0g/L.As a result，under the optimum fermentation conditions，Lys·HCl productivity was enhanced from 111g/L to 151g/L，and conversation rate from glucose to lysine acid was 50.2%.

Brevibacterium flavum;temperature control;fed－batch fermentation;residual glucose;ammomia nitrogen

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0242－04

L－赖氨酸是人体和动物不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种。赖氨酸是目前国际市场上发展前景良好的产品，大约每年生产100万t，消费需求逐年递增［1］。由于食物中赖氨酸含量很低，加工过程中易被破坏，引起赖氨酸缺乏，故常称为第一限制氨基酸，其广泛应用于食品、饲料和医药工业，在平衡氨基酸组成方面起着重要的作用。全球约90%的赖氨酸用作饲料添加剂，约5%用作食品添加剂，其余5%用作医药中间体［2］。近几年，饲料级赖氨酸出口市场持续良好发展，各大厂家为了争夺有限的市场份额都有增产或扩厂计划，市场竞争尤为激烈［3］。为了降低生产成本，提高产量，本文主要从温度、残糖和氨氮方面来调控整个发酵过程。微生物的生长和产物的合成均需在其各自合适的温度下进行。温度是保证酶活性的重要条件，在发酵过程中必须保证最适宜的温度环境［4］，温度控制在谷氨酸、乳酸发酵中应用较多，在赖氨酸的生产中较少。为了达到产酸最大化，本文将梯度发酵温度策略应用于赖氨酸发酵工艺中，并通过控制残糖和氨氮在最适范围内，使其发酵性能得到最大的发挥，为赖氨酸工业提供新思路。

2011－06－14 *通讯联系人

廉少杰(1985－)，男，硕士研究生，主要从事菌种选育及发酵条件优化的研究。