秸秆基质中木质素白腐菌降解的SEM特征观察

徐 伟，王丽婷

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076)

秸秆基质中木质素白腐菌降解的SEM特征观察

徐 伟，王丽婷

(哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江哈尔滨150076)

研究了黄孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium Burdsall)对大豆和稻草秸秆中木质素的降解条件及降解效果。结果显示:在各5.0g秸秆中，加入合成培养液12mL、菌悬液浓度8.6×106cfu/mL时，种子添加量为0.8mL、培养基pH4.5，降解10d，测得木质素降解率分别为大豆秸秆49.91%、稻草秸秆49.50%。利用SEM对发酵前后秸秆表观结构进行观察，得到黄孢原毛平革菌对大豆和稻草秸秆有明显的降解效果。经黄孢原毛平革菌降解10d的大豆和稻草秸秆表面空穴增多、增大，甚至相互连通，降解效果明显。

大豆秸秆，稻草，黄孢原毛平革菌，木质素，扫描电镜(SEM)

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)购于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)，菌种编号:40719;大豆秸秆 内蒙古莫旗;稻草 黑龙江省五常农村;PDA培养基 去皮马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，pH自然;种子培养基［6］葡萄糖20g/L，玉米浆50mL/L，(NH4)2SO40.1g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，VB10.5mg/L;发酵培养基 称取5.0g大豆秸秆粉(稻草粉)于250mL三角瓶中，加入合成培养液，高压蒸气 121℃灭菌20～30min，取出后备用;合成培养液［7－8］(NH4)2SO415g/L、KH2PO44.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl20.2g/L、VB110mg/L、FeSO4·7H2O 0.1g/L、CoCl2·6H2O 0.1g/L、ZnSO4·7H2O 0.1g/L、CuSO4·5H2O 0.02g/L、AlK(SO4)2·12H2O 0.02g/L、Na2B4O7·10H2O 0.05g/L、(NH4)2MoO4·4H2O 0.02g/L、吐温－80 3mL/L。

LZDX－50KB高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;DHG－9123电热恒温鼓风干燥箱、DHP9162恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;HZQ－C空气浴振荡器 哈尔滨东联电子开发技术有限公司;S－3400N扫描电子显微镜 HITACHI。

1.2 木质素含量测定方法

采用王万玉系统分析法［10］:

2 结果与分析

研究黄孢原毛平革菌对木质素降解率的影响因素包括:合成培养液添加量、接种量和pH，均在温度为35℃，湿度为86%的恒温培养箱中培养10d。

2.1 合成培养液添加量对降解率的影响

在培养基初始pH 4.5条件下，将种子液以每瓶0.8mL的接种量分别接到合成培养液添加量为6、8、10、12、14、16mL灭好菌的发酵的培养基中，测定10d后秸秆中木质素的降解率，结果如图1所示。

图1 合成培养液添加量对大豆和稻草秸秆木质素降解率的影响Fig.1 The effect of the amount of synthesis adding liquor on the degradation rate of soybean straw lignin and rice straw lignin

固体发酵培养时，合成培养液添加量过高，三角瓶内的湿度高、溶氧量低不易于菌体生长，菌体产酶量低，导致木质纤维素降解率低。合成培养液添加量过低，同样会影响菌体生长，导致木质纤维素降解率低。在合成培养液添加量为12mL时，大豆秸秆和稻草秸秆木质素降解率最高，分别为 49.91%和49.24%。

2.2 接种量对降解率的影响

将种子液(孢子悬液浓度8.6×106cfu/mL)、分别以0.2、0.5、0.8、1.1、1.4、1.7mL的接种量接种到已加入12mL合成培养液、初始pH4.5发酵培养基中，测定10d后秸秆中木质素降解率，结果如图2所示。

在实验室进行固体发酵时营养条件是一定的，接种量低，菌体之间生存竞争少，菌体生长良好利于菌体产酶，但发酵周期长。接种量高，菌体之间生存竞争激烈，虽发酵周期短，但不利于菌体产酶，降解率低。不同菌种对环境条件以及营养条件的不同需求，导致会有不同的适宜接种量。对于不同的菌种，接种量的选取是十分重要的。由图2可知接种量达到0.8mL时，大豆和稻草秸秆木质素降解率为49.35%和46.21%。

图2 接种量对大豆和稻草秸秆木质素降解率的影响Fig.2 The effect of inoculation on the degradation rate of soybean straw lignin and rice straw lignin

2.3 培养基初始pH对降解率的影响

将种子液以每瓶0.8mL的接种量接种到已加入12mL合成培养液的培养基中，调节pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，测定10d后秸秆中木质素降解率，结果如图3所示。

图3 pH对大豆和稻草秸秆木质素降解率的影响Fig.3 The degradation law’s effect of soybean straw lignin and rice straw lignin by pH

培养基初始pH直接影响菌株生长和代谢活动，一般要求初始pH应使菌株快速生长而且有利于目标物质的代谢合成。黄孢原毛平革菌最适生长pH通常为弱酸性。由图3可以看出pH为4.5时，大豆和稻草秸秆木质素的降解率最高。这可能是偏酸性条件一方面会促进白腐菌的生长，另一方面是由于木质纤维素酶系的最适pH偏酸性，能使分泌的酶保持较高的活性。侯红漫［11］等认为当pH低于3时，不利于白腐菌菌体的生长，pH高于6时，虽然可以让菌体生长良好，但是不利于酶的合成。

2.4 秸秆降解的表征分析观察(SEM)

白腐菌降解大豆和稻草秸秆时，分泌木质素过氧化物酶系、锰过氧化物酶系、漆酶及过氧化氢酶等，使大豆和稻草秸秆的表面受到破坏。研究秸秆表观结构在发酵中的变化，为深入探讨白腐菌降解木质素的效果提供参考。通过黄孢原毛平革菌对木质素降解率的影响因素的实验，最后得到加入合成培养液12mL、种子添加量为0.8mL、培养基pH4.5条件下木质素降解率是最高的。图4是大豆和稻草秸秆降解前后横切面和内外表面扫描电镜结果。

图4 白腐菌以大豆与稻草秸秆为基质降解10d后SEM结果Fig.4 The SEM results of degradation of soybean straw and rice straw by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall for 10d

由图4(a)、(b)、(e)、(f)可知，原始大豆秸秆表面及内部纤维束均匀、整齐、平滑，呈自然伸展状态，结构紧密规整，质地坚硬。维管内部结构致密、光滑，空穴偶有可见，横切面维管束壁结构比较紧凑;秸秆表面光滑，被一层蜡所覆盖，无空穴。原始稻草秸秆的表观结构紧密规整，稻草秸秆内表面光滑，被一层蜡所覆盖，无空穴;外表面有些许凸起粗糙，结构紧密无缝隙。

大豆和稻草秸秆经过黄孢原毛平革菌降解10d后，由图4(c)、(d)可见，大豆秸秆结构遭到严重破坏，横截面图可明显发现无完整维管束，大部分已被破坏;空穴增多、增大，秸秆被严重破坏。图4(g)、(h)可见稻草秸秆的内、外表面均存在很多的裂缝和孔洞。

3 结果与讨论

木质素是由苯基－丙烷结构单元通过醚键、碳－碳键联结而成的具有三维结构的芳香族高分子化合物［12－15］。木质素很难降解，同时也无法形成发酵性糖类，黄孢原毛平革菌中含有降解木质素能力的酶类。通过实验得到在合成培养液12mL、种子添加量为0.8mL、培养基pH 4.5条件下，经黄孢原毛平革菌降解10d木质素降解率最高，测得降解率分别为大豆秸秆49.91%、稻草秸秆49.50%。同时通过大豆和稻草秸秆降解10d与未降解时的SEM对比观察发现，降解10d的大豆和稻草秸秆表面空穴增多、增大，甚至相互连通，说明降解效果明显。

黄孢原毛平革菌降解大豆和稻草秸秆时，先降解秸秆表面木质素，生成空穴，之后菌丝通过空穴进入秸秆内部，分泌酶系进一步降解秸秆内部成分。黄孢原毛平革菌反应条件温和、处理成本低、能耗低、专一性强、不存在环境污染等优点。可见由黄孢原毛平革菌降解农作物秸秆，使其资源化、环境化，是具有可行性的。

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Observation and utilization of characteristics of white－rotfungi degrades lignin of the straw’s stroma by SEM

XU Wei，WANG Li－ting

(College of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

The degradation law of soybean straw lignin and rice straw lignin by Phanerochaete chrysosporium was studied.The results showed that the amount of synthesis adding liquor was 12mL and quantity was 0.8mL in the two kind 5g straw powder，the quantity of inoculum which concentration of Phanerochaete Chrysosporium Burdsall was 8.6×106cfu/mL，inoculation was 0.8mL，the medium of initial pH was 4.5，the degradation time was 10d.Then the degradation rates of the soybean straw lignin was 49.91%and the rice straw lignin was 49.50%，respectiely.By using scanning electron microscopy(SEM)，the apparent structure of straw before and after fermentation was observed.The results showed that the capacities of degrading soybean straw and rice straw by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall was strong.The surface holes of soybean straw and rice straw increased in number and largen in volume and evensome linked together after degradation for 10d by Phanerochaete Chrysosporium Burdsall.The degradation impaction was obvious.

soybean straw;rice straw;Phanerochaete Chrysosporium Burdsall;lignin;SEM

TS210.1

A

1002－0306(2012)08－0225－03

黑龙江省是全国农业大省，大豆秸秆和稻草产量非常大，但大多秸秆资源被焚烧，造成了大气污染。秸秆是一种丰富的纤维素资源，在木质纤维质原料的细胞壁结构中，纤维素是被木质素和半纤维素包裹着的，因此，将木质素降解，对其进行预处理，是提高纤维质原料后续发酵效率的重要方式。利用微生物降解大豆和稻草秸秆中的木质素，是使其资源化、环境化的有效途径。秸秆主要由木质纤维素以及少量蛋白质、脂肪、醇类、醛、酮和有机酸等组成［1－3］，木质纤维素由木质素、纤维素、半纤维素三者构成［4］。大豆秸秆木质素含量约为18%、稻草秸秆木质素含量约为15%［5］。以含有木质素的农业废弃物秸秆为基质，利用黄孢原毛平革菌降解木质纤维素的复杂结构，对于有效地利用和转化秸秆资源，扩大发酵产品工业原料来源，减少工业用粮，降低发酵产物成本，都具有一定的现实意义。

2011－07－04

徐伟(1963－)，女，博士，副教授，研究方向:微生物发酵工程。

黑龙江教育厅科技面上项目(12511130)。