木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白水解条件的研究

高丹丹，徐纪平，李贞子

(西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)

木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白水解条件的研究

高丹丹，徐纪平，李贞子

(西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)

采用马铃薯渣为原料提取马铃薯蛋白，用木瓜蛋白酶对其进行水解。研究水解时间、温度、pH和酶与底物浓度比(E/S)四个因素对水解过程的影响。以水解度(DH)为评价指标，在单因素实验的基础上，采用Box－Benhnken响应面分析法，优化木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白质的工艺条件。结果表明，在酶与底物浓度比为6000U/g时，最佳的水解条件为:温度为64.70℃、pH为7.41、水解反应时间3.12h。在此条件下，水解度为20.19%。

木瓜蛋白酶，马铃薯蛋白质，水解度(DH)，响应面，Box－Benhnken

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯渣 甘肃省兰州市榆中县金芋淀粉厂提供;木瓜蛋白酶(500U/mg) 北京中生瑞泰科技有限公司;TCA、茚三酮、正丁醇、氢氧化钠、盐酸等其他试剂 均为分析纯。

FE220型中型粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司;3K18型高速冷冻离心机 德国Sigma公司; PB－10型精密pH计 Sartorius公司;GL－3250B型控温磁力搅拌器 江苏其林贝尔仪器制造有限公司; MP－500B型电子天平 上海天平总厂;Labconco Freezoneil型台式冻干系统 照生公司;HH－SH－4型电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂;6010型紫外分光光度计 惠普有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 马铃薯蛋白的提取工艺［6］马铃薯渣粉20g→加600mL蒸馏水→用1mol/L的NaOH溶液调节体系的pH→浸提4h→4000r/min离心15min→分离出上清液→用1mol/L盐酸溶液调节上清液的pH为4.5→8000r/min离心15min→得到蛋白质凝乳沉淀→冷冻干燥→马铃薯蛋白粉(蛋白质含量91.07%)。

1.2.2 马铃薯蛋白酶解液的制备［7］配制一定浓度的马铃薯蛋白质溶液，加氢氧化钠或盐酸调节pH至酶的最适pH，然后按比例加入木瓜蛋白酶，在适当的温度条件下进行水解，95℃水浴灭酶15min，然后加入一定量的10%的TCA(三氯乙酸)，4℃条件下8000r/min离心15min，沉降酶蛋白以及未酶解的马铃薯蛋白质，取上清液直接使用或保存在－20℃等待分析使用。

1.2.3 水解度的测定 水解度的测定方法采用茚三酮比色法［8］。

式中:Ah为不同时间酶解液中的总游离氨基数，mmol;A1为原料蛋白强酸水解后的总游离氨基数，mmol;A0为原料蛋白中固有的游离氨基数，mmol。

1.2.4 酶解条件的单因素实验设计 单因素实验设计以DH(水解度)为评定指标，研究不同的酶解时间、温度、pH和酶与底物浓度比(E/S)对木瓜蛋白酶水解效果的影响，确定各因素的最佳水平。

1.2.5 响应面实验设计 根据单因素实验结果，采用响应面设计实验，运用Box－Behnken的中心组合实验设计原理［9］，选择对水解度具有显著影响的三个因素:温度(A)、pH(B)和反应时间(C)采用三因素三水平的响应面实验设计，见表1。

表1 Box－Behnken实验设计Table 1 Experimental design and variables levels for Box－Behnken

1.2.6 实验数据分析 采用F检验对实验数据进行方差分析以评价模型的统计意义［10］，数据分析软件采用Design Expert 6.0。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的单因素实验分析

2.1.1 反应时间对水解效果的影响 在酶与底物浓度比为6000U/g、温度为50℃、pH=7.5的条件下，每隔1h测定其水解度。水解度曲线如图1所示，不同水解时间木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的水解程度不同，水解度随时间的增加而增加，前4h水解度增加的幅度明显，4h后，水解度增加趋势缓慢，趋于稳定，因此认为，在工业生产中，选定最佳的酶解时间为4h。

图1 水解时间对水解效果的影响Fig.1 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.1.2 pH对水解效果的影响 在酶与底物浓度比为6000U/g、温度为50℃、酶解时间为4h的条件下，将反应液的pH分别调节为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，然后置于反应瓶中进行水解反应，测定其水解度。

pH对酶促反应的影响是多方面的，过酸或过碱都会使酶发生可逆性或不可逆性的失活，也可通过改变酶的空间构象而使其失活，且pH还可以改变底物的解离状态，影响其与酶的结合［9］。每种蛋白酶都有其和底物反应的最适合pH范围，通过实验，由图2可知，pH为7.5时水解度最高，因此，可确定木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的酶解反应的最适pH为7.5。

图2 pH对水解效果的影响Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.3 温度对水解效果的影响 在酶与底物浓度比为6000U/g、pH为7.5、酶解时间为4h的条件下，将反应物分别置于40、45、50、55、60和65℃的温度下进行酶解反应，取酶解液测定其水解度。

不同温度条件下的木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的水解度曲线如图3所示，由图3可知，温度由40℃上升至55℃过程中，水解度升高，而当温度继续升至65℃时，水解度逐渐降低。由于温度对酶促反应的影响包括两方面:一方面，随温度的升高而使蛋白酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶的反应速度;另一方面，当温度升高时反应速度也加快。在高于最适温度时，前一种效应为主，在低于最适温度时，后一种效应为主，因而酶活性丧失，反应速度下降。因此，可确定酶解反应的最适温度为55℃。

2.1.4 E/S对水解效果的影响 在温度为60℃、pH 7.5、酶解时间为4h的条件下，将马铃薯蛋白质溶液置于E/S分别为2000、4000、6000、8000和10000U/g的反应瓶中进行酶解反应，取酶解液测定其水解度。

图3 温度对水解效果的影响Fig.3 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

不同E/S条件下的木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的水解度曲线如图4所示，由图4可知，随着加酶量的增大，水解度也相应地增大。但E/S从6000U/g (包括6000U/g)往上增加时，水解度的增幅较小，从实际生产中经济成本方面考虑，在不显著影响水解度的情况下，加酶量应尽量减少以降低成本，因此可确定酶解反应的最适E/S为6000U/g。

图4 酶与底物浓度比(E/S)对水解效果的影响Fig.4 Effect of the substrate/enzyme ratio on the degree of hydrolysis

2.2 木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白响应面实验分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立与检验 木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的响应面分析实验依据 Box－Behnken中心法设计了17组实验，其中包括5组中心点重复实验，实验的数据结果如表2所示。

利用Design Expert 6.0软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合，得到木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的回归方程为:Y=15.90﹢3.68A－1.13B－0.18C+0.42A2－1.38B2－3.31C2+0.25AB－2.67AC－1.69BC。

对该模型进行方差分析，结果如表3所示。由表3中数据可知，本实验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(P＜0.0001)［8］。失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.0953＞0.05)，说明未知因素对实验的结果干扰小［11］，其决定系数为0.9972，校正决定系数为 0.9936，说明该二次多项模型能解释99.36%的响应值的变化，仅仅只有总变异的0.64%不能用该二次多项模型来解释，表明该模型的拟合度良好，用此模型可以对木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的水解过程进行优化。

对回归方程的回归系数进行显著性检验，结果如表4所示。由表4中数据可知，实验中A、B、A2、B2、C2、AC和BC这七个因素对水解度的影响显著，表明在木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的过程中，温度和pH对水解度有显著的影响;且由于AC和BC显著，说明水解的过程中，温度和水解反应时间以及pH和水解反应时间之间的交互作用也会对水解度造成显著影响。

表2 Box－Behnken实验设计及实验数据结果Table 2 Box－Behnken design matrix and the experimental results

表3 二次多项模型方差分析结果Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

表4 回归方程系数显著性检验结果Table 4 Regression coefficients and their significance of the quadratic model

2.2.2 响应面分析及优化 通过上述二次多项模型方程的建立可得出一系列响应面的曲面图，如图5～图7所示。通过动态图即可对任意两种因素的交互作用影响水解度的效应进行分析和评价，并且可以从中确定最佳因素的水平范围。等高线的形状可以反映出交互作用影响效应的强弱与大小，椭圆形表示两种因素的交互作用影响显著，而圆形则恰好与之相反，表示这两种因素的交互作用影响不显著［12］。

由图5可以看出温度与pH对水解度的交互作用的影响效应。从等高线图可知，温度与pH的交互作用影响不显著。将水解时间固定在0水平时，酶解液的水解度随着pH和温度的升高而增加，到达最大值后开始降低，在低温和低pH条件下，酶的活性很差。从图5中也可以看出木瓜蛋白酶的耐高温性比较强，当温度高于65℃时才开始逐渐失活。

图5 温度与pH交互作用影响水解度的响应曲面图Fig.5 Response surface graph of the effects of variables on the degree of hydrolysis versus temperature and pH

图6显示了温度与水解反应时间对水解度的交互作用的影响效应。其等高线图呈现椭圆形，表明温度与水解反应时间的交互作用影响显著。当把pH固定在0水平(pH为7.5)，响应值最大可以达到20.61%。

图6 温度与反应时间交互作用影响水解度的响应曲面图Fig.6 Response surface graph of the effects of variables on the degree of hydrolysis versus temperature and time

图7 pH与反应时间交互作用影响水解度的响应曲面图Fig.7 Response surface graph for the effects of variables on the degree of hydrolysis versus pH and time

图7反映了pH与水解反应时间对水解度的交互作用的影响效应。从图7中的等高线图及曲面图可知，pH与水解反应时间这两种因素对水解度的交互作用影响显著。可见pH对响应值的影响较大，在适当的pH条件下，随着水解时间的增加，水解度呈增大趋势。

2.2.3 模型验证实验 根据Box－Behnken实验所测得的结果以及二次多项回归方程，再利用 Design Expert 6.0软件可获得本实验水解度最高时的各因素的最佳水解条件为温度64.70℃、pH为7.41、水解反应时间3.12h。在此水解条件下，水解度为20.45%。对此优化条件进行验证实验，重复进行三次，取得木瓜蛋白酶酶解马铃薯蛋白的水解度为 20.16%、20.08%和20.33%，平均值为20.19%，与理论计算值的误差在±1%以内，可见该模型能较好地预测实际的水解情况。

3 结论

本研究通过单因素实验，确定了最适加酶量为6000U/g，最适温度为55℃，最适pH为7.5，最适水解反应时间为4h。以此为基础，并且以水解度为最终评价指标，通过Box－Benhnken响应面分析法对木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的水解条件进行优化，得出最佳的水解条件为温度64.7℃、pH为7.41、水解反应时间3.12h。在此水解条件下，水解度为20.19%。通过方差分析可知，温度与pH对水解度的影响是显著的，温度和水解反应时间以及pH和水解反应时间之间的交互作用对水解度的影响也是显著的，温度和pH对水解度的交互作用影响是不显著的。由此可知，响应面分析法可以有效地优化木瓜蛋白酶水解马铃薯蛋白的水解条件，这对马铃薯蛋白的开发和利用有一定的参考意义。

［1］刘水长.发展马铃薯产业大有可为［J］.中国粮食经济，2004(10):43－45.

［2］Meister E，Thompson N R.Protein quality of precipitate from waste effluent of potato chip processing measured by biological methods［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，24 (5):924－926.

［3］焦驼文，孔繁东，祖国仁，等.酶解蛋白制备抗氧化多肽的研究现状与展望［J］.中国酿造，2007(3):5－7.

［4］张泽生，郭宝芹，刘素稳.不同酶水解马铃薯蛋白的分析评价［J］.食品研究与开发，2009，30(1):112－114.

［5］Peng X Y，Xiong Y L，Kong B H.Antioxidant activity of peptide fractions from whey protein hydrolysates as measured by electron spin resonance［J］.Food Chemistry，2009，113(1): 196－201.

［6］高丹丹，李海星，曹郁生，等.棉籽蛋白提取工艺研究［J］.食品工业科技，2009(5):267－269.

［7］Gao D D，Li H Y，Cao Y S.ACE inhibitory activities of peptide fractions derived from cottonseed protein hydrolysate［J］. African Journal of Biotechnology，2010，53(9):8977－8983.

［8］何照范，张迪清.保健食品化学及其检测技术［M］.北京:中国轻工业出版社，1997:141－142.

［9］Box G P，Behnken D W.Some new three level design for the study of quantitative variables［J］.Technometrics，1960(2): 456－475.

［10］高丹丹，常通，曹郁生，等.响应面法优化中性蛋白酶水解棉籽蛋白工艺［J］.食品科学，2009，30(16):153－157.

［11］王霞，苏秀榕，丁进锋，等.响应面法优化双酶水解黄鳍金枪鱼胰脏的工艺研究［J］.现代食品科技，2010，26(11): 1229－1233.

［12］余勃.枯草芽孢杆菌发酵豆粕生产大豆活性多肽的研究［D］.南京:南京农业大学，2006:50－66.

Study on the optimum conditions of the hydrolyzation of potato protein by papain

GAO Dan－dan，XU Ji－ping，LI Zhen－zi
(College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China)

Potato protein was extracted from potato pulp and hydrolyzed by papain.The influences of the hydrolysis time，temperature，pH，and substrate/enzyme ratio on the degree of hydrolysis of potato protein were investigated. On the basis of single factor tests and Box－Benhnken response surface methodology，the optimal working parameters were worked out and tested.The optimum hydrolysis parameters were as follows:when the substrate/ enzyme ratio was 6000U/g，the potato protein was hydrolyzed for 3.12h at temperature 64.70℃under pH 7.41，and the degree of hydrolysis was reached 20.19%.

papain;potato protein;hydrolysis degree;response surface;Box－Benhnken

TS201.2+1

A

1002－0306(2012)08－0267－05

马铃薯的蛋白含量约为2%，折合成标准水分后，蛋白质含量远远高于小麦、水稻和玉米等粮食作物，可达到10%左右［1］。马铃薯蛋白含人体所必需的8种主要的氨基酸，由于其赖氨酸含量高而可与谷物蛋白营养互补，故马铃薯蛋白具有较高的营养价值。马铃薯蛋白的必需氨基酸平衡要优于其它植物蛋白，与全鸡蛋和酪蛋白相当，是一种很好的食用蛋白［2］。但长期以来，马铃薯蛋白作为马铃薯淀粉生产的副产品，大部分用做肥料，只有少部分用做反刍动物饲料，没有得到很好的开发利用，造成了蛋白质资源的极大浪费。近年来国内外学者利用不同的植物蛋白质，通过酶的水解对其改性，制备各种各样的生物活性多肽［3］。目前，国内外比较普遍的是将大豆蛋白经蛋白酶水解并经分离、精制后得到分子量低于1000为主的低聚肽混合物［4］。但是，采用蛋白酶水解马铃薯蛋白，制备生物活性肽的研究还很少见，因此具有较大的研究空间。酶解可使原来蛋白质的功能特性发生很大变化，这些特性的改变很大程度上取决于水解度的大小。有研究表明，在一定时间内，产物水解度的大小和其生物活性的高低呈正相关［5］。所以，对水解工艺进行优化和控制具有十分重要的现实意义。本研究立足国内外对植物蛋白研究的热点，以马铃薯渣为原料提取马铃薯蛋白，采用木瓜蛋白酶对其进行水解，在单因素实验的基础上，利用响应面分析法对水解条件进行优化，并获得最佳的水解条件，从而为马铃薯蛋白的开发和利用奠定基础。

2011－06－07

高丹丹(1983－)，女，博士，副教授，研究方向:食品生物技术。

西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金资助(zyz2011072);甘肃省青年科技基金计划(1107RJYA018)。