DPPH自由基清除活性评价方法在抗氧化剂筛选中的研究进展

熊双丽，卢 飞，史敏娟，吴照民

(1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010; 2.西南科技大学食品科学研究所，四川绵阳621010)

DPPH自由基清除活性评价方法在抗氧化剂筛选中的研究进展

熊双丽1，2，卢 飞1，史敏娟1，吴照民1，2

(1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010; 2.西南科技大学食品科学研究所，四川绵阳621010)

1，1－二苯基－2－苦基肼(1，1－Diphenyl－2－picryl－hydrazyl，DPPH)自由基是合成的以氮为中心的稳定自由基，结构简单，反应容易控制，已广泛应用于各种物质提取物或纯化合物的抗氧化活性的评价和筛选。论文详述了目前国内外DPPH自由基应用于抗氧化剂的抗氧化活性评价的测定方法(分光光度法、电子顺磁共振法、电化学法和反相高效液相液色谱法)、原理，以及应用特性。

DPPH自由基，抗氧化，原理，应用

1 分光光度法测定抗氧化剂的DPPH自由基清除活性

1.1 抗氧化剂的DPPH自由基清除原理

DPPH自由基有机溶液呈紫色，在波长为517nm波长处具有最大光吸收。DPPH－比色法主要利用自由基清除剂提供一个电子与DPPH自由基的孤对电子配对(图1)，使自身紫色变为黄色，在517nm波长处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除能力越强，吸光度越小。

图1 DPPH自由基结构及其与自由基清除剂相互作用原理Fig.1 DPPH chemical structure and its reaction with a scavenger，indicated by A－H

1.2 各种因素对抗氧化剂DPPH－分光光度法测定的影响

DPPH－比色法仅需要分光光度计，简单、方便，实验条件容易满足，适合于大量样品的筛选，但其容易受诸多因素影响，如有机酸、表面活性剂、无机盐、缓冲液，以及样品本身颜色，造成DPPH自由基清除率评价的差异。

1.2.1 有机酸对抗氧化剂DPPH自由基清除活性的影响 大部分果蔬中存在有机酸、维生素C、多酚类化合物等，绝大部分研究者在研究果蔬中维生素和多酚类化合物的抗氧化活性时，并没有注意有机酸的影响。一般情况下，也就是纯有机酸的情况下，有机酸(乙酸、柠檬酸和苹果酸)无DPPH自由基清除活性。但是，它们与其它抗氧化剂混合后便会影响它们的DPPH自由基清除效率。Roberto Scalzozo在评价乙酸、柠檬酸和苹果酸对维生素C的自由基清除效果影响时，发现在没有维生素C时，三种有机酸不会引起DPPH自由基结构变化，没有任何自由基清除作用，但与维生素C混合后，它们都显著增加维生素C的自由基清除效果，并呈现剂量依赖性［7］。因此，在评价果蔬中抗氧化剂的自由基清除效果时，须考虑其它成分的影响。

1.2.2 无机盐和缓冲液对抗氧化剂DPPH自由基清除活性的影响 AI－Dabbas等［8］研究了25种无机盐、两种缓冲液对DPPH自由基的清除效果，以及它们对丁基羟基甲苯(BHT)、儿茶酚和varthemia自由基清除率的影响。研究结果发现，硫代硫酸钠和氯化亚铁在10ug/mL时，DPPH自由基清除率分别为65.3%和47.70%。当浓度超过5ug/mL时，硫代硫酸钠对DPPH自由基的清除率不再继续增加，而碘、碘化钾、偏重亚硫酸钾和铁氰化钾对DPPH自由基的清除率较弱。磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾、氟化钾、溴化钾、硝酸钾、碳酸钙、氯化钠等在浓度为1～400ug/mL时，都不影响DPPH自由基颜色变化，没表现出自由基清除活性，但是，氯化镁、亚硫酸钾和硫酸钾却增加了DPPH自由基的颜色，表现出轻微的促氧化特性。在0.01～0.2mmol/L浓度范围内，乙酸缓冲液无DPPH自由基清除活性，而磷酸盐缓冲液却增加DPPH自由基颜色，表现出轻微的促氧化特性。磷酸氢二钾和碳酸钾本身无DPPH自由基清除活性，与BHT混合后，却显著增加BHT的DPPH自由基清除活性。因此，不同盐溶液或缓冲液显著影响众多植物和动物提取物的自由基清除活性评价效果。

1.2.3 表面活性剂对抗氧化剂DPPH自由基清除活性的影响 Al－Dabbas等［9］研究了阳离子型、非离子型、阴离子型表面活性剂，以及混合表面活性剂对芦丁DPPH自由基清除活性的影响，发现它们对DPPH和芦丁溶解性影响大小依次为阳离子型、非离子型和阴离子型表面活性剂。离子型表面活性剂对芦丁DPPH自由基清除活性的提高程度大于非离子型表面活性剂，阳离子－阴离子表面活性剂混合物优于任意单一表面活性剂，而阴离子－非离子型表面活性剂混合物介于纯阴离子和非离子表面活性剂之间。表面活性剂对芦丁DPPH自由基清除活性的影响可能归结为它们的结构差异，通过与芦丁的静电相互作用或氢键相互作用等，形成不同的结构体系。因此，食品、化妆品和药品都含有大量的表面活性剂，在评价其活性成分时，需考虑各类乳化剂对其活性成分的影响。

并不是所有抗氧化剂的DPPH自由基清除活性都能用比色法来测定，如该法不能准确测定4－硝基－2－苯氧甲烷磺酰苯胺、对位氨基双苯砜和阿司匹林等药物的抗氧化活性。近年来，相继采用高效液相色谱、化学发光法、电子顺磁共振法和电化学方法测定抗氧化剂的DPPH自由基清除活性。

2 电子顺磁共振技术测定抗氧化剂对DPPH自由基的清除活性

电子顺磁共振(Electron Paramagnetic Resonance，EPR)是直接检测和研究含有未成对电子的顺磁性物质现代分析方法，具有简单、灵敏度高、样品不受破坏和无干扰等优点，是目前检测自由基最直接、最有效的方法之一，适用于抗氧化剂自由基增抑能力的研究［10－11］。由于DPPH自由基是稳定的顺磁化合物，适合于EPR检测，尤其是某些物质在517nm有强吸收的时候，更应该选择DPPH－EPR法检测抗氧化剂的自由基清除活性。例如，类胡萝卜素，在517nm存在有强吸收，干扰吸光值的测定，不能采用分光光度法测定，EPR便成为其理想的检测手段。该法直接测定自由基浓度，显著提高分析的准确性［6］。

3 电化学方法测定抗氧化剂对DPPH自由基的清除活性

电化学是研究电和化学反应相互关系的科学。电化学分析法具有仪器简单、操作方便、分析速度快等特点，已广泛应用于药品、食品、生化制品，以及材料等的分析检测。Ruzi等利用生物传感器测定丁羟基茴香醚(BHA)的抗氧化特性，建立了电化学法测定抗氧化剂自由基清除活性的方法［12］。Chevion等利用低分子化合物的还原特性，采用循环伏安法(CV)测定血浆低分子化合物的抗氧化特性［13］。该法简单、灵敏、重复性强，血浆样品6个月内测定值一致。对于标准抗氧化剂抗坏血酸和尿酸的自由基清除值，其检测结果与HPLC－电化学分析一致。在此基础上，Milardovic'等发展了电化学安培检测法和循环伏安法测定抗氧化剂的DPPH自由基清除特性。两者均采用标准三电极电化学电池，工作电极和辅助电极都为电极玻璃碳电极，Hg2Cl2|3mol/L KCl电极为参比电极。循环伏安测定中峰电流为20mV/s。该法适合于评价水溶性或醇溶性的纯化合物、茶溶液、酒，以及橘子汁等饮料。测定结果与分光光度法测定结果高度相关(Trolox等值抗氧化活性，R2=0.9993)［5］。由于经典分光光度法测定易受样品颜色和浊度影响，需要进行样品的预处理，增加测定程序。碳电极安培检测法具有较好的化学稳定性，并且样品颜色与浊度不影响检测器的反应，提高了检测的准确性。

表1 评价抗氧化剂DPPH自由基清除效率的指标及特性Table 1 Index and property about evaluating DPPH free radical－scavenging activity of antioxidant

4 高效液相色潽法测定抗氧化剂对DPPH自由基的清除活性

高效液相色潽法(HPLC)具有快速、分离效率高、稳定性好等特点。通过配备不同检测器，它已广泛应用于生物制品、药品、化学品、食品等的分离分析。近年来，国内外学者已将HPLC法引入自由基的测定，提高了分析的效率和准确性等［14］。Yamaguchi等采用DPPH－HPLC评价各类公认抗氧化剂和商业饮料，并与经典比色法进行了比较，发现 DPPHHPLC法测定简便快速，不受影响颜色影响，适合于有色食品如咖啡、红酒、橙汁等液体物质的自由基清除活性测定［15］。此后，该法已应用于粗提物和药物抗氧化剂的测定［16］。Chandrasekar等采用RP－HPLC测定中药制剂的抗氧化活性，以甲醇和水的混合物(甲醇∶水=80∶20，V∶V)为流动相，流速1mL/min，DPPH吸收峰于517nm处检测，计算其IC50。并用已知抗氧化剂抗坏血酸、6－羟基－2，5，7，8－四甲基苯并二氢吡喃－2－羧酸(trolox)、普罗布考和α－生育酚进行校正。DPPH－HPLC与DPPH－比色法测定上述公认的标准抗氧化剂时，结果具有较高的相关性，前者通过反相C18进行分离DPPH自由基，再进行吸光值的测定，消除了样品颜色和自身光吸收的影响。其准确性、精确性高，重复性高于后者，而且简单方便［3］。DPPH－HPLC的测定值显著小于DPPH－比色法，而且重复性强，这可能是因为中药制剂中的各种成分颜色和浓度等干扰DPPH的颜色，影响比色测定值。DPPH－HPLC法中DPPH自由基经过HPLC分离后再进行检测，不受其它物质干扰，准确性增加，可以用来测定植物提取物、食品、药物，以及中药制剂的抗氧化活性评价和筛选。因此，与DPPH－EPR法和DPPH－电化学法相比，DPPH－HPLC操作原理、方法和图谱分析简单，而且仪器和色谱柱容易获得，是次之于分光光度法的一种简易测定方法。

5 DPPH自由基清除效率评价指标

评价和比较各类抗氧化剂DPPH自由基清除活性的指标包括DPPH自由基清除率、半数抑制浓度(IC50)、抗氧化剂活性指数、Trolox等值抗氧化活性、抗坏血酸等值抗氧化活性等，常见指标及特性如表1。

6 结论

DPPH自由基结构简单、性质稳定、反应容易控制，是未来抗氧化剂自由基清除活性筛选的首选试剂。经典分光光度法与新发展的高效分析分离法(电子顺磁共振法、电化学法和高效液相液色谱法)相比，简便、快速，不受昂贵仪器限制，适合于一般企业和研究单位进行大批量的抗氧化剂筛选或检测。但是，该法容易受样品颜色和浓度、DPPH浓度，以及反应条件等影响，以后的研究必须考虑各类影响因素，建立标准的DPPH－分光光度检测法和完善的评价指标。电子顺磁共振法、电化学法和高效液相液色谱法检测快速、简单、准确性和精确性高，重复性强，干扰少，适合于抗氧化剂自由基清除效果的精细测定。然而这些方法对DPPH自由基的测定还不够成熟，以后须考虑各类抗氧化剂的特性和DPPH自由基反应特性等，研究不同测定参数对测定值的影响，建立相应的标准检测方法和评价指标。

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Advanement of evaluation methods about DPPH radical scavenging activity in Screening Antioxidant

XIONG Shuang－li1，2，LU Fei1，SHI Min－juan1，WU Zhao－min1，2
(1.School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China; 2.Institute of Food Science，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China)

1，1－Diphenyl－2－picryl－hydrazyl(DPPH)was a stable free radical which was synthesized and had an unpaired valence electron at one atom of nitrogen bridge.It had been extensively applied in screening and evaluation of antioxidants in various biomass because its structure was simple and the reaction of it was easy to control.This article elaborated assay methods(spectrophotometry，electron paramagnetic resonance，electrochemistry and HPLC)，principles and application properties about DPPH scavenging capacity of various antioxidants.

DPPH radical;antioxidation;principle;application

TS202.3

A

1002－0306(2012)08－0380－04

自由基生物学和自由基医学的飞速发展表明，自由基与癌症、衰老、各种心血管疾病、帕金森综合症等各种急性和慢性疾病密切相关［1］。与此同时，具有自由基清除活性的合成或天然抗氧化剂已成为国内外医学、药学、生物学、食品和材料等学科领域的研究热点。评价和筛选自由基清除剂的方法包括体内和体外实验。体内实验费时费力，不适于大量抗氧化剂的筛选。绝大部分研究集中于体外模拟测定，主要包括DPPH自由基、羟基自由基、超氧自由基，以及氮自由基等［2］。DPPH自由基是一种合成的、具有单电子、稳定的、以氮为中心的顺磁化合物。当自由基清除剂存在时，DPPH自由基接受一个电子或氢原子，形成稳定的DPPH－H化合物，使其甲醇(或乙醇)溶液从深紫色变为黄色，变色程度与其接受的电子数量(自由基清除活性)成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析(见图1)。由于DPPH自由基结构简单，反应容易控制，已广泛应用于动植物提取物或者单一化合物的抗氧化特性评价。但是，分光光度法测定抗氧化剂DPPH自由基清除活性方法，易受DPPH浓度、反应时间、光照强度、pH，以及反应溶剂等因素影响，造成同一物质在不同的研究条件下具有不同的抗氧化活性，标准抗氧化剂抗坏血酸和二丁基羟基甲苯等也不例外［3－4］。因此，近年来发展了更为准确的高效液相色谱、化学发光法、电子顺磁共振法和电化学方法进行DPPH自由基清除活性检测［5－7］。本文主要归纳总结了国内外最新的DPPH自由基测定方法、原理与应用特性，为广大研究者提供一定参考。

2011－09－20

熊双丽(1977－)，女，博士，副教授，研究方向:天然产物研究与开发。

西南科技大学博士基金项目(06zx7122);绵阳市科技局项目(10Y004－1)。