硬脂酰氯改性对茶多酚抗油脂氧化性能的影响

申 雷，章建浩，*，靳国锋

(1.国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，南京农业大学，江苏南京210095; 2.教育部肉品加工与质量控制重点实验室，南京农业大学，江苏南京210095; 3.农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，南京农业大学，江苏南京210095)

硬脂酰氯改性对茶多酚抗油脂氧化性能的影响

申 雷1，2，3，章建浩1，2，3，*，靳国锋1，2，3

(1.国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，南京农业大学，江苏南京210095; 2.教育部肉品加工与质量控制重点实验室，南京农业大学，江苏南京210095; 3.农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，南京农业大学，江苏南京210095)

茶多酚的众多亲水性酚羟基使其难溶解于油脂而影响其对油脂的抗氧化效果，为提高茶多酚抗油脂氧化性能，采用硬脂酰氯对其改性，以茶多酚与硬脂酰氯的摩尔配比、催化剂用量和反应温度为实验因素，以添加改性茶多酚的油脂经高温氧化后的POV为考察指标，采用响应曲面法优化工艺条件，并采用红外、紫外光谱表征分子结构，结果表明:反应温度与硬脂酰氯添加量对POV有显著交互作用(P＜0.05)，即反应温度的临界值随硬脂酰氯添加量升高呈线性增加趋势;最佳工艺下油脂POV为5.711meq/kg，比对照组(添加普通茶多酚)降低33.9%;改性后出现亚甲基和直链脂肪基团的特征吸收峰，说明硬脂酰氯与茶多酚的酚羟基形成酯化交联，改善了茶多酚亲脂性，从而显著提高茶多酚抗油脂氧化效果。

茶多酚，硬脂酰氯，亲脂改性，响应曲面法，抗氧化性

茶多酚(Tea Polyphenols，TP)是一种高效天然抗氧化剂，具有抑制肿瘤、延缓衰老、预防疾病等功效［1］，其主要功能性物质儿茶素类能够抑制自由基引发的脂质过氧化［2］，还可与肉品脂质中的微量Fe2+螯合，抑制Fe2+的催化氧化活性［3］;但茶多酚分子中众多的亲水性酚羟基使其难溶于油脂而影响其抗氧化效果［4］，因此有学者探索普通茶多酚的改性方法，以制备既具有高脂溶性、又具备强吸附自由基能力的改性茶多酚(Modified Tea Polyphenols，MTP);已有文献报道如溶剂法、乳化法、分子修饰法(酚羟基酯化法、苯环氢原子取代法、C环羟基酯化法)等［5］，其中酚羟基酯化法是最常用的方法之一，基本原理为儿茶素酚羟基与脂肪酸氯化物进行酯化交联而改善其油溶性［6］。国内外相继推出了改性茶多酚用于油脂的抗氧化，如聂芊等［7］采用豆油脂肪酸酐改性茶多酚，发现产物豆油脂肪酸茶多酚酯具有较好的油溶性和抗氧化性能;王洪新等［8］将普通茶多酚与丙酸酐、棕榈酸酰氯、油酸酰氯进行非水相酯化反应，发现使用棕榈酸酰氯进行改性的效果最佳;Sakai［9］等利用羧酸酯酶合成3－O－儿茶素的系列物质，终产物添加到油脂中溶解性能良好，抗氧化诱导时间比空白组延长一倍;但以上研究报道普遍改性效果不理想或成本较高。本研究采用普通茶多酚为基质，硬脂酰氯为改性剂，在茶多酚主体成分儿茶素的酚羟基上引入亲脂性的硬脂酸，将得到的改性物用于油脂抗氧化;应用响应曲面法研究不同因素影响酯化反应的规律，为开发新的高效天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶多酚 杭州禾田生物科技有限公司，纯度99%，其中儿茶素70%，相对分子量约为420;大豆油 南京邦基粮油有限公司;硬脂酰氯 工业纯;甲苯磺酸、乙酸乙酯、氯仿、冰乙酸、无水乙醇等 分析纯。

BRUKERTENSOR－27型红外光谱仪 德国布鲁克公司;UV－2450型紫外分光光度计 日本岛津公司;722S型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 硬脂酰氯改性茶多酚单因素实验 按照表1进行硬脂酰氯改性茶多酚的单因素实验。反应物配比作单因素的实验条件为催化剂用量0.100g/1.000g TP，反应温度40℃;催化剂用量作单因素的实验条件为反应物配比1∶4、反应温度40℃;反应温度作为单因素的实验条件为反应物配比1∶4，催化剂用量0.075g/1.000g TP。对照组均为经过高温破坏性实验的普通茶多酚。

表1 硬脂酰氯改性茶多酚制备工艺单因素实验Table 1 Single test on technologic condition of preparation of modified tea polyphenols using stearyl chloride

1.2.2 硬脂酰氯改性茶多酚响应曲面实验 采用Box－Benhnken Design响应面优化法设计实验，各自变量水平的选取根据单因素实验结果进行确定，具体见表2。

1.2.3 茶多酚改性工艺流程 量取40.0mL乙酸乙酯倒入250mL锥形瓶，依次加入目标量的催化剂、硬脂酰氯以及茶多酚，旋转条件下在一定温度水浴中反应6h，待反应结束后，用滤纸过滤掉未反应的固体物，得到乙酸乙酯深红色液体，用2倍体积的蒸馏水洗涤至溶液呈中性，再于80℃下真空蒸出乙酸乙酯，最后将得到的茶多酚在40℃条件下干燥，研磨成粉末状，过120目筛，置于自封袋低温避光保存备用。

表2 硬脂酰氯改性茶多酚响应曲面实验因子水平编码表Table 2 Code and level of factors chosen for the trials of preparation of modified tea polyphenols using stearyl chloride

1.2.4 油脂的抗氧化实验 为提高工作效率，进行如下的高温破坏性实验:取等量豆油8.00g于小烧杯中，加入质量分数为0.4%的改性茶多酚样品，超声混匀，同时设立只添加普通茶多酚的对照组，将上述油样置于(100±1)℃烘箱内24h(脂肪酸在高温下极易氧化分解)，24h后立即测定指标。

1.2.5 POV测定 按GB/T5009.37－2003《食用植物油卫生标准的分析方法》中过氧化值的测定方法。

1.2.6 脂溶性测定 参照卢聪聪［10］的方法，称取10mg改性茶多酚样品溶于10mL氯仿中，超声10min使其溶解，配成质量浓度为1.0g/L的溶液(或悬浮液)，测之前在微型旋涡混合仪上混匀，然后用可见分光光度计测定溶液(或悬浮液)在800nm下的透光率。

1.2.7 茶多酚分子官能团的光谱测定 红外光谱:使用BRUKERTENSOR－27型红外谱仪，在400～4000cm－1范围，取1～2mg样品粉末，然后和KBr混合均匀并压片，扫描后得到特征谱带。

紫外光谱:称取普通茶多酚和改性茶多酚各10mg，分别用无水乙醇稀释至质量浓度为120mg/L，使用UV－2450型紫外分光光度计，在波长200～380nm范围内进行扫描，得到特征谱带。

1.2.8 数据分析处理方法 实验重复3次。用SAS8.2统计软件进行方差分析，不同平均值之间利用Fisher’s最小显著差异法(LSD)进行差异显著性检验;用Design Expert 7.1.6建立响应曲面回归方程。

2 结果与讨论

2.1 硬脂酰氯改性茶多酚单因素实验结果

2.1.1 反应物配比对茶多酚抗氧化性和脂溶性的影响 如图1所示，添加改性茶多酚的油脂其POV随着反应物配比的增加呈现出先降低后增加的趋势，变化显著(P＜0.05)。反应物配比1∶4时，POV最低(3.678±0.193)meq/kg，比对照组普通茶多酚(8.637 ±0.638)meq/kg降低了57.4%。随着反应配比增大超过1∶4之后，抗氧化性下降，可能硬脂酰氯过量导致产物不纯，影响产物的抗氧化作用。同时，研究发现，超过1∶4摩尔比的茶多酚和硬脂酰氯并未能与茶多酚上的酚羟基全部反应，虽然旷英姿［11］认为儿茶素分子中酚羟基数目的平均值为7，但茶多酚分子中众多酚羟基由于各自所处的化学环境和反应活性都不同，只能是活性较强位点的酚羟基参与反应;随着反应进行，当再有硬脂酸进入茶多酚分子结构中时，必然限制其再与更多的硬脂酰氯发生酯化反应［13］，因此推测本实验条件下的茶多酚分子中有4个左右活性较强的酚羟基发生了交联反应。同时，改性物的脂溶性随着反应物配比的增加先增加后降低，变化显著(P＜0.05)。反应物配比1∶3时，脂溶性达到最高66.1%±0.4%。相关性分析结果表明改性物抗氧化性和脂溶性显著相关(P＜0.05)，Pearson相关系数高达－0.93，即脂溶性的提高有利于其在油脂中发挥抗氧化作用。

图1 反应物配比对茶多酚抗氧化性和脂溶性的影响Fig.1 Effect of reactant proportion on antioxidation activity and solubility of tea polyphenols

2.1.2 催化剂用量对茶多酚抗氧化性和脂溶性的影响 如图2所示，添加改性茶多酚的油脂其POV随着催化剂用量的增加而呈现出先缓慢降低后增加的趋势，0.025、0.05、0.1、0.125g之间差异不显著(P＞0.05)。催化剂用量0.075g时，POV最低(3.376± 0.323)meq/kg。同时，改性物的脂溶性随着催化剂用量的增加没有呈现出一定的变化规律，只在催化剂用量0.075g时达到最大值90.2% ±0.1%。二者Pearson相关系数为－0.80。

图2 催化剂用量对茶多酚抗氧化性和脂溶性的影响Fig.2 Effect of catalyst use level on antioxidation activity and solubility of tea polyphenols

2.1.3 反应温度对茶多酚抗氧化性和脂溶性的影响

如图3所示，添加改性茶多酚的油脂其POV随着反应温度的增加而呈现出先降低后增加的趋势，变化极显著(P＜0.01)。反应温度60℃时，POV最低(4.612±0.060)meq/kg，比对照组普通茶多酚(8.637 ±0.638)meq/kg降低了46.6%。温度过低，反应速度慢，从而使得茶多酚改性不充分;温度过高，虽可促使茶多酚中更多的酚羟基参与酯化反应，但同时加速茶多酚氧化成醌的反应，使产物的抗氧化活性降低［15］。同时，改性物的脂溶性随着反应温度的升高保持持续增大的趋势，且变化极显著(P＜0.01)。相关性分析结果表明二者之间中度相关，Pearson相关系数为0.60。

图3 反应温度对茶多酚抗氧化性和脂溶性的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on antioxidation activity and solubility of tea polyphenols

2.2 以POV为目标函数的响应曲面实验

2.2.1 回归模型建立及其显著性检验 表3为响应曲面分析实验结果。

表3 BBD响应曲面实验设计及POVTable 3 Box－Benhnken design response surface experiment arrangement and POV

利用Design－Expert软件对表3实验数据进行多元回归拟合，得到以反应物配比、催化剂用量和反应温度为自变量，改性茶多酚抗油脂氧化POV为因变量的二次多项回归模型为:

表4的方差分析表明，响应面回归模型Prob＞F =0.0110，达到显著水平(P＜0.05)，模型失拟性(P= 0.1416＞0.05)不显著，说明该二次模型能够拟合真实。验证实验表明相对误差仅为2.70%。因此可用此模型分析和预测改性茶多酚的抗油脂氧化。

表4 响应曲面二次模型方差分析结果Table 4 ANOVA for response surface quadratic model

表5 回归模型系数显著性检验Table 5 Test for significance of regression coefficients

2.2.2 响应曲面实验各因素交互效应分析 根据反应物配比(A)与反应温度(C)交互影响的曲面图(图4)，可以看出其交互效应显著(P＜0.05)。总体上在反应温度较低时，反应物配比对油脂POV的影响是上升趋势，即配比越低越有利;而反应温度较高时，反应物配比对油脂POV的影响是下降趋势，即配比越高越有利，这可能是因为反应温度的升高，改变了乙酸乙酯溶剂体系中的茶多酚和硬脂酰氯的活性和酯化反应进行的程度，生成不同量的改性茶多酚，进而对POV的高低产生影响。陈荣义［14］采用吡啶催化茶多酚和乙酸酐的合成反应，结果表明反应物摩尔配比为1∶3.9，反应温度为40℃时最优，但其并没有研究二者之间的交互作用。另外，反应物配比较低时，反应温度越高越有助于反应;而随着配比的继续增加即超过1∶4时，随着反应温度升高，其对POV影响的趋势变成先下降后上升，可能因为不同的反应物配比意味着不同的茶多酚和硬脂酰氯相对质量比，在低反应物配比下(1∶3)，即硬脂酰氯分子数量少，参与酯化反应的硬脂酰氯相对不足，所以需要较高温度来促进反应的进行。

图4 实验因素A和C交互影响抗氧化性的响应曲面图Fig.4 Response surface graph of the function of barrier to antioxidation activity of experimental factors A and C

为深入探究二次多项回归模型所反映的交互作用机制，选取B因素为0水平，A因素分别取－1.0、－0.5、0.0、0.5、1.0(即1∶3、1∶3.5、1∶4、1∶4.5、1∶5)，可得一组以POV为目标函数、反应温度C为自变量的一元二次方程，分析每个POV一元二次方程都存在一个最低值，对应的自变量(反应温度C)即为临界值，从而获得不同反应物配比条件下相应反应温度的五个临界值分别为:－0.5844;－0.4318;－0.2792;－0.1266;0.0325;大于或小于此临界值，都会引起POV的升高;再以A因素五个点对应的反应温度x为自变量，相应的五个临界值为响应指标进行回归，得到如图5所示的线性回归方程，发现反应温度临界值随反应物配比增大呈线性增加趋势，具体为硬脂酰氯每增加1mol，需额外升高反应温度3.078℃才能保持POV处于最低点。同理，选取B因素为0水平，C因素分别取－1.0、－0.5、0.0、0.5、1.0(即50、55、60、65、70℃)，最终得到如图6的线性回归方程，发现反应物配比临界值随反应温度升高呈线性增加趋势，即反应温度每升高10℃，需额外增加1.068mol的硬脂酰氯才能保持POV处于最低点。

图5 反应物配比取不同水平时所对应的回归方程Fig.5 Corresponding regression equation when reactant proportion is chosen for different levels

图6 反应温度取不同水平时所对应的回归方程Fig.6 Corresponding regression equation when reaction temperature is chosen for different levels

图7显示了催化剂用量(B)和反应温度(C)对改性茶多酚抗油脂氧化POV的交互效应影响情况。从图7中可以看出，反应温度对改性茶多酚抗油脂氧化POV影响的最适值几乎不受催化剂用量多少的影响，仍然是反应温度从50℃上升到约57℃时POV呈现下降趋势，当反应温度大于57℃时，POV又随着反应温度的升高开始上升。本实验所采用的对甲苯磺酸作为酯化反应的催化剂时，具有选择性强、产品色泽好、污染少等优点［15］，一般情况，苯酚的酚羟基与羧酸的酯化反应都在沸煮高温条件下进行，而本实验低于此范围，可能由于较低的温度条件减少了分子间的碰撞机会［16］，导致二者的交互作用并不显著(P＞0.05)。

2.2.3 最优改性工艺 经过响应曲面分析得出改性茶多酚工艺因素的最优组合为:反应物配比1∶3.83、催化剂用量0.0748g、反应温度56.7℃，油脂POV为5.711meq/kg。改性茶多酚抗油脂氧化最优组POV比对照组(添加普通茶多酚)POV降低33.9%。

图7 实验因素B和C交互影响抗氧化性的曲面图Fig.7 Graph of response surface of the function of barrier to antioxidation activity of experimental factors B and C

2.3 改性茶多酚最优组的光谱分析

2.3.1 红外光谱分析结果 图8是普通茶多酚(TP)的红外光谱图，与图9改性茶多酚(MTP)红外光谱图对比发现，二者的共同点为:TP和MTP分子中都有酚羟基(3705～3125cm－1)、羰基(1740～1690cm－1)和苯环(1650～1430cm－1)官能团存在，说明硬脂酰氯对茶多酚的酚羟基只是进行部分修饰，并没有大幅度改变茶多酚整体结构。二者的不同点为:MTP分子中出现亚甲基在2936～2916cm－1、2863～2843cm－1处，以及碳原子数大于4的直链脂肪基团－(CH2)n在720cm－1处的特征吸收峰，而TP分子并没有上述吸收峰，这说明改性茶多酚分子中亚甲基和脂肪长链官能团的存在，即茶多酚分子中引入了硬脂酸烃基长链，茶多酚的酚羟基和硬脂酰氯发生酯化交联。由于茶多酚在分子修饰前后的组分相当复杂，故只作初步的定性分析。

图8 普通茶多酚红外光谱图Fig.8 IR spectrum of common tea polyphenols

2.3.2 紫外光谱分析结果 如图10所示，普通茶多酚(TP)和改性茶多酚(MTP)分别有两个吸收峰，两峰所对应的波长分别为:TP:229.0nm和277.0nm，LTP:217nm和276.5nm，可以看出TP分别比LTP红移12.0nm和0.5nm。Caterine［17］等研究表明，在黄酮类化合物中，增加酚羟基数目会使紫外吸收峰红移，由此可见茶多酚中的花黄素作为一种黄酮类化合物，经改性后其酚羟基的数量发生减少。由于红移现象主要在A环峰上，表明多数硬脂酰氯分子和茶多酚A环上的酚羟基发生酯化交联，而只有少数与B环上的发生交联，根据赵保路［18］等用量子化学的计算结果，非没食子儿茶素的活性中心在A环，没食子儿茶素的活性中心在B环，酯化反应作为一种亲电反应，电子云密度越高反应越易进行，儿茶素C7位上氧原子前线轨道电子占有率最高，从而可以进一步判断酯化反应多数在A环上的C7位点，A环酚羟基的活泼性在本实验的条件下要比B环上的强。

图9 改性茶多酚红外光谱Fig.9 IR spectrum of modified tea polyphenols

图10 改性前后茶多酚的紫外光谱Fig.10 Ultraviolet spectrum of tea polyphenols(TP) and modified tea polyphenols(MTP)

3 结论

采用硬脂酰氯分子修饰改性茶多酚，使茶多酚主体物质儿茶素A环位点与硬脂酰氯发生酯化交联，能显著提高茶多酚的脂溶性。高温破坏性实验条件下(100℃，24h)，改性茶多酚最优组的油脂POV比普通茶多酚降低33.9%。影响油脂POV的因素大小依次是反应温度＞催化剂用量＞反应物配比;反应温度与反应物配比的交互作用对油脂POV影响显著(P＜0.05)，具体为反应温度的临界值随硬脂酰氯添加量升高呈线性增加趋势，同时过高或过低的反应温度都不利于提高茶多酚抗氧化性能。以POV为目标函数的回归优化改性茶多酚工艺参数为反应物配比1∶3.83、催化剂用量0.0748g、反应温度56.7℃。用硬脂酰氯改性茶多酚，能有效降低油脂POV，显著提高茶多酚在油脂中抗氧化性。

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Influence of stearyl chloride modification on antioxidation of tea polyphenols for oil

SHEN Lei1，2，3，ZHANG Jian－hao1，2，3，*，JIN Guo－feng1，2，3
(1.National Center of Meat Quality and Safety Control，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;2.Key Lab of Meat Processing and Quality Control，Ministry of Education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;3.Key Laboratory of Food Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

The antioxidation of tea polyphenols(TP)for oil was influenced by their numerous hydrophilic phenolic hydroxyls.In order to increase antioxidation of tea polyphenols for oil，stearyl chloride(SC)modification method was adopted.A response surface experiment using reactant proportion(mole proportion of TP and SC)，catalyst use level and reaction temperature as experimental factors and POV of overheated oil added with modified tea polyphenols(MTP)as responses was carried out.The processing conditions were optimized and the molecular structures were analysed by infrared spectrum and ultraviolet spectrum.Based on the models established，Interaction effect of reactant proportion and reaction temperature was significant(P＜0.05)，it was indicated that the critical value of reaction temperature presented a linear increase trend with the addition of stearyl chloride. Under optimum conditions the POV was 5.711meq/kg，which was 33.9%lower than that of the control group (added with TP).Characteristic absorption peaks of methylene and straight fat chain indicated that esterification cross－linking was formed between stearyl chloride and phenolic hydroxyls of tea polyphenols，the solubility of tea polyphenols was improved，so the antioxidation of tea polyphenols for oil was increased significantly.

tea polyphenols;stearyl chloride;lipophicity modification;response surface methodology;antioxidant

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0159－06

2011－07－18 *通讯联系人

申雷(1987－)，男，硕士研究生，研究方向:畜产品加工与质量控制。

国家公益性农业科研专项(200902012)。