荧光PCR快速检测A、C、G群溶血性链球菌

林 霖，兰全学，祝仁发，2，杨国武，*

(1.深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518131; 2.佛山市农业局，广东佛山528000)

荧光PCR快速检测A、C、G群溶血性链球菌

林 霖1，兰全学1，祝仁发1，2，杨国武1，*

(1.深圳市计量质量检测研究院，广东深圳518131; 2.佛山市农业局，广东佛山528000)

克服现有文献中PCR检测方法仅能检测兰氏A群链球菌的局限，建立适用于溶血性链球菌群全族群的荧光PCR快速检测方法，实现与国家标准GB/T 4789.11－2003检测范围一致。通过文献搜索以及杆菌肽敏感实验，对国标检验范围进行界定。使用CLUSTAL X软件寻找兰氏A、C、G群保守序列并设计特异性引物和探针，同时通过特异性实验、模拟污染实验以及方法比对实验验证该方法的特异性、检出限及可靠性。特异性实验结果表明，该方法能特异扩增兰氏A、C、G群链球菌;模拟污染实验表明，在增菌18h后增菌液最低初始污染菌含量分别为3、50、2CFU/mL时，兰氏A、C、G群链球菌可被检出。110份样品比对实验结果表明与国标检测方法实验结果一致。该方法可应用于食品中溶血性链球菌的快速检测，并可为快速检测溶血性链球菌国家标准的建立提供参考。

实时荧光PCR，溶血性链球菌，检测，食品

近年来食品安全问题已成为公众关注的焦点问题，而微生物污染造成的食源性疾病仍是世界食品安全中最为突出的问题。溶血性链球菌属于链球菌属，其广泛存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫或皮肤、粘膜伤口感染传播，而被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会使人类感染［1］。关于链球菌属的分类，目前国内外使用最为广泛的为兰氏分类法，按菌株的血清学特征将链球菌属进行分类，常见血清型为兰氏A、B、C、G群等。国家标准GB/T 4789.11－2003对溶血性链球菌的检验采用传统的增菌划线分离鉴定方法，其周期长、步骤繁琐并且对操作人员经验要求较高，不适宜快速检测的需求，而近年来兴起的实时荧光PCR技术具有简单、快速、灵敏、准确的特点，适合于食品中致病菌的快速筛查［2］。溶血性链球菌在国家标准中规定为乙型溶血、链激酶阳性、杆菌肽阳性的革兰氏阳性链球菌，但未说明所检测链球菌的血清群。在以往的报道中符合革兰氏阳性球菌、乙型溶血、链激酶阳性的链球菌包含了兰氏A、C、G群［3］，但关于杆菌肽阳性链球菌包含的血清群则无相关报道。因此本研究通过对链球菌属的几个代表株进行杆菌肽敏感实验，对国标检验范围进行了界定，并根据菌株序列设计特异性扩增引物及探针，建立了符合国家标准检验范围且可同时检测兰氏A、C、G群链球菌的实时荧光PCR快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

标准菌株 美国典型菌种保藏中心(ATCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)、中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)、国家兽医微生物菌种保藏中心、中国药品生物制品检定所、中国科学院微生物研究所、广东微生物所、军事医科院，菌株购买之后使用API鉴定试剂条进行菌株鉴定确认，具体菌株来源信息详见表1及表2;杆菌肽纸片(纸片直径6mm、含量为0.04μg/片) 杭州天和微生物试剂有限公司;营养肉汤、葡萄糖肉浸液肉汤培养基 北京陆桥技术有限责任公司;血琼脂平皿 郑州安图绿科生物工程有限公司;API鉴定试剂条 法国梅里埃公司;实时荧光PCR反应试剂Premix ExTaq(2×)宝生物工程(大连)有限公司;引物、探针 上海生工生物工程有限公司。

7500实时荧光PCR仪 美国ABI公司;SHP－250恒温培养箱、DK－8D水浴锅 上海精宏公司;纯水机 美国Millipore公司;Allegra 64R离心机 美国Bekman公司。

1.2 实验方法

1.2.1 初始菌悬液制备 待检菌株用血琼脂平皿划线分离，37℃培养18～24h，挑取典型单菌落再划线接种血琼脂平皿，37℃培养18～24h;挑取菌落用灭菌生理盐水稀释至0.5麦氏单位浓度，制成初始菌悬液。

1.2.2 杆菌肽敏感实验 每种待检菌初始菌悬液取200μL涂布血琼脂平皿，稍干后每个平皿贴2片杆菌肽纸片，两纸片距离平皿边缘和两纸片间距约30mm，37℃培养24h。记录出现抑菌圈的菌株。

1.2.3 引物及探针的设计 溶血素S为导致溶血性链球菌乙型溶血特征的主要因素［4－6］，于NCBI数据库中下载编码溶血素S的靶基因序列，其来源于兰氏A、C、G群链球菌的全基因组序列(NC_004070.1，NC_008022.1，NC_003485.1，NC_002737.1，NC_ 007297.1，NC_007296.1，NC_008021.1，NC_008023.1，NC_011375.1，NC_008024.1，NC_011134.1，NC_ 012891.1)。采用CLUSTAL X软件进行序列比对，在SagA基因中找到了一段仅保守于兰氏A、C、G群链球菌中的特异性序列，共71bp。并在此序列中设计特异性引物及探针，引物序列在NCBI网站Primer－BLAST中进行特异性搜索，而探针序列在NCBI网站nucleotide BLAST中进行特异性搜索，搜索结果均显示能特异性扩增兰氏A、C、G群链球菌。正向引物序列为:5’－GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA－3’;反向引物序列为:5’－AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA－3’;探针序列为:5’－AAACAACTCAAGTTGC TCCTGGAGG－3’，5’端标记 FAM，3’端标记TAMRA。

1.2.4 实时荧光PCR反应体系及程序 反应体系(20μL):正向引物(20μmol/L)0.4μL，反向引物(20μmol/L)0.4μL，探针(20μmol/L)0.2μL，Premix ExTaq(2×)10μL，灭菌超纯水4μL，DNA模板5μL。

反应程序:95℃3min;95℃15s，60℃34s，40个循环。

结果判断:Ct值≤35时，可判定检测结果为阳性;Ct值≥40时，可判定检测结果为阴性;35＜Ct值＜40时，需适当增加模板量重复扩增，如果得到Ct值≤35，则可判定检测结果为阳性，否则判定检测结果为阴性。

1.2.5 水煮法制备模板 取1mL增菌液置于1.5mL离心管中，12000r/min离心10min，去除上清液，收集菌体。加入100μL灭菌超纯水，混匀，100℃沸水中水浴10min。12000r/min离心10min，取上清液作为反应模板。

1.2.6 特异性实验 选取35种常见食源性致病菌(见表2)用营养肉汤增菌，按1.2.5制备模板，按1.2.4进行实时荧光PCR反应和结果判断。

1.2.7 模拟污染实验 选取兰氏A、C、G群链球菌代表菌株按照1.2.1进行初始菌悬液制备，制成初始菌悬液菌液浓度10－1～10－8倍的菌悬液;取浓度为10－4～10－6的菌悬液100μL涂布血琼脂平皿，每个浓度梯度设置两个平行，37℃培养24h，按GB4789.2－2010进行菌落计数，并得出原菌液中实际含菌量。按照GB/T4789.11－2003中的方法对牛奶样品进行检验，确认未检出溶血性链球菌后作为模拟污染源。取25mL牛奶样品至225mL灭菌超纯水中混匀制备成样品稀释液，取1mL各梯度菌悬液至9mL样品稀释液中混匀，再吸取1mL各个污染菌液的样品稀释液至9mL葡萄糖肉浸液肉汤培养基中，制备成菌含量分别为101、102、103、104CFU/mL的增菌液并将其置于37℃培养，并分别在培养0、4、8、18h时取出并吸取1mL增菌液按照1.2.5制备模板，并按照1.2.4进行实时荧光PCR反应以及结果判断。各种菌的各个浓度梯度设置三个重复。

1.2.8 方法比对实验 将样品按GB/T4789.11－2003进行样品稀释和增菌后，吸取1mL增菌液按照1.2.5制备模板，并按照1.2.4进行实时荧光PCR反应以及结果判断。同时，将增菌液按国家标准GB/T4789.11－2003进行后续实验，并比对结果。

2 结果与分析

2.1 杆菌肽敏感实验结果

如表1所示，在血琼脂平皿上显示出乙型溶血特性以及杆菌肽敏感特性的链球菌菌株仅包括兰氏A、C、G群链球菌，由此可以推断国家标准中规定的“溶血性链球菌”为兰氏A、C、G群链球菌。

2.2 特异性实验结果

在35种常见食源性致病菌中，所设计的引物和探针能够特异的对兰氏A、C、G群链球菌进行扩增，扩增结果详见表2和图1。

表1 杆菌肽敏感实验结果Table 1 Results of bacitracin sensitive experiment

图1 特异性实验结果图Fig.1 Specificity of real－time fluorescence PCR assays for the detection of Streptococcus hemolyticus

2.3 模拟污染实验结果

通过模拟污染实验，对所设计的引物及探针在兰氏A、C、G群链球菌中的检出限进行检测，实验结果如表3所示。兰氏A群链球菌在增菌18h后在增菌液初始菌含量为3CFU/mL时可检出;兰氏C群链球菌在增菌18h后在增菌液初始菌含量为50CFU/mL时可检出;兰氏G群链球菌在增菌18h后在增菌液初始菌含量为2CFU/mL时即可检出。

2.4 方法比对实验结果

对110批次样品进行检测方法的比对实验，实验结果如表4所示，国标检测方法及实时荧光PCR检测方法均未在样品中检出溶血性链球菌，两种方法的检测结果完全一致。

表4 样品比对实验结果Table 4 Compareing national standards method with real－time fluorescence PCR assaysby detection of Streptococcus hemolyticus in samples

3 讨论

过去普遍认为溶血性链球菌感染主要由兰氏A群链球菌引起，然而文献报道表明兰氏C、G群链球菌引起的疾病也不容忽视［7］。统计数据表明1975～1995年间英国由兰氏G群链球菌感染导致的疾病出现了显著增长［8］。而近年来国内外关于兰氏C、G群链球菌引起疾病爆发的文献报道也日益增多［9－12］。原因可能由于兰氏C、G群链球菌与兰氏A群链球菌引起的感染症状极为相似，因此在以往的鉴定中容易将其误认为是兰氏A群链球菌感染［7－8，12］。兰氏C群链球菌包括类马链球菌、兽疫链球菌和马链球菌，会导致人畜共患病，人类因食用动物源性食品而感染［13］。而兰氏G群链球菌的感染主要是由于乙型溶血的停乳链球菌似马亚种，此菌株在以往被归入兰氏C群，而后通过分子分型的手段将其归为兰氏G群，其具有A、C、G三种血清型抗原，并且其感染引起的症状与兰氏A群链球菌极为相似［7－8，13］。

表2 特异性实验结果Table 2 Results of specificity detecting by real－time fluorescence PCR assays

表3 模拟污染实验结果Table 3 Result of simulated contamination experiment detecting by real－time fluorescence PCR assays

溶血性链球菌的致病因子主要包括溶血素、链激酶、M蛋白等。对引起疾病爆发的菌株进行分析发现，兰氏A群链球菌99%的菌株编码M蛋白，但兰氏C、G群则只有大约50%的菌株编码M蛋白［8］。链激酶虽然在兰氏A、C、G群链球菌中均有编码，但C、G群的链激酶等位基因与A群的有较大差别，兰氏C、G群链球菌中也仅有2个共有等位基因［14］。因此M蛋白和链激酶的编码基因均无法作为同时检验兰氏A、C、G群链球菌的靶基因位点。乙型溶血是溶血性链球菌的重要致病因子，链球菌中存在三种溶血素，即溶血素O、溶血素S和溶血素β－h/c，溶血素O具有抗原性，但对氧不稳定;溶血素β－h/c是导致B群溶血性链球菌乙型溶血特征的主要因素;溶血素S则特异存在于A、C、G群溶血性链球菌中，其是一种小分子多肽，不具有抗原性，但对氧稳定，是导致A、C、G群溶血性链球菌乙型溶血特征的主要因素［4－6］。溶血素S由30个氨基酸组成，其分子量为2.8ku，由SagA－I 9个基因协同表达，SagA为结构基因，SagB－I为调控基因［6］。通过序列比对软件，比对编码溶血素S的基因序列，在SagA基因序列中找到一段仅保守于兰氏A、C、G群链球菌的特异性序列，在该特异性序列上设计引物及探针，经过荧光PCR反应，可以实现同时检验兰氏A、C、G群链球菌。

该方法可在检出培养18h的兰氏A、C、G群链球菌，其增菌液的最低初始菌含量分别为3、50、2CFU/ mL。其中兰氏A、G群检出限相似，这是由于其靶基因序列之间的相似度较兰氏C群高，导致引物对其扩增效率较兰氏C群高引起的。这也与文献中描述的兰氏G群与兰氏A群序列相似度极高一致［7－8，13］。

目前国内外文献报道的溶血性链球菌检验方法中，有对其培养基进行改进的，但依然限制于传统划线分离方法［15］;也有采用实时荧光PCR技术的，但是其检测范围仅限制于兰氏A群链球菌［16－17］;也有采用LAMP技术的，虽然该方法快速简便，但由于设计引物位点包含6个保守区域，特异性极高，也仅限制于兰氏A群链球菌［18］。鉴于国标检验范围包含了兰氏A、C、G群链球菌，因此不宜采用。而本次研究建立的以SagA为靶基因的实时荧光PCR检测方法，实时荧光PCR整个实验过程仅需1h，大大缩短了检验时间，并且其操作简便、灵敏度高，可应用于实际检测中。此方法的建立也可为国家标准的修订提供参考。

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Rapid detection of group A，C and G Streptococcus hemolyticus by using real－time fluorescence PCR assays

LIN Lin1，LAN Quan－xue1，ZHU Ren－fa1，2，YANG Guo－wu1，*
(1.Shenzhen Academy of Metrology Quality Inspection，Shenzhen 518131，China; 2.Foshan Municipal Agriculture Bureau，Foshan 528000，China)

In order to beyond the limits that current real－time PCR method could only detect group A Streptococcus，a new method was established using real－time fluorescence PCR assays with detection range consistent to the national standard GB/T4789.11－2003.Bacitracin sensitive experiment was used to validate the detection range of Streptococcus hemolyticus in the national standard GB/T4789.11.Group A，C and G Streptococcus were selected and the DNA sequences of which were aligned using CLUSTAL X software. Conserved region of DNA sequences was used for the designing of primers and taqman probe.Method using real－time fluorescence PCR assays was constructed.The specificity，sensitivity and accuracy of this method were tested.Sensitivity experiment demonstrated that the new method could successfully distinguish the group A，C and G Streptococcus serotype from non－group A，C and G Streptococcus and other serotype.Simulated contamination experiment showed that after 18h culture at least 3，50 and 2CFU/mL of group A，C and G Streptococcus respectively could be tested by the new method from the enrichment broth.Accuracy test experiment was performed and completely same result was found either using the new method or national standard methods.This real－time fluorescence PCR assays could be used to rapid detection of Streptococcus hemolyticus in food，and might provide the reference for the national standards revision.

real－time PCR;Streptococcus hemolyticus;detection;food

TS207.4

A

1002－0306(2012)08－0078－05

2011－07－28 *通讯联系人

林霖(1987－)，女，硕士，研究方向:食品生物化学。

国家质检总局科技计划项目(2008QK272)。