正交设计优选檀香叶总黄酮提取工艺

余文新，庄满贤，林 励，*，邓瑞云，彭丽诗，李丽月

(1.广东省中医院药学部，广东广州510120;2.广州中医药大学，广东广州510006)

正交设计优选檀香叶总黄酮提取工艺

余文新1，庄满贤2，林 励2，*，邓瑞云2，彭丽诗2，李丽月2

(1.广东省中医院药学部，广东广州510120;2.广州中医药大学，广东广州510006)

以檀香叶为原料，在单因素实验基础上，以乙醇浓度、提取时间、料液比、提取次数为考察因素，以总黄酮含量为考察指标，采用正交实验优化最佳提取工艺。在实验影响因素中，影响程度从大到小依次为乙醇浓度＞提取次数＞料液比＞提取时间。实验结果表明:檀香叶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度60%，提取时间20min，料液比1∶40，提取次数为1次。此工艺条件较为稳定，檀香叶总黄酮可达3.24%。

檀香叶，总黄酮，正交设计，提取工艺

檀香叶 采自湛江南药实验场，经林励研究员鉴定为檀香科植物檀香(Santalum album L.)的叶子，干燥后粉碎备用，现保存于广州中医药大学实验管理中心;芦丁对照品 中国药品与生物制品鉴定所提供，批号100080－200707;乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等 均为分析纯试剂。

Agilent 8453E紫外可见分光光度计 P.R.China; DFY200－粉碎机 浙江温岭市大德中药机械有限公司制造;PrecisaXS225A电子分析天平 d=0.0001g，Switzerland;KQ3200B超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司，功率500W，频率40kHz。

1.2 实验方法

1.2.1 檀香叶总黄酮含量测定

1.2.1.1 供试品溶液的制备 取檀香叶粉末约1g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，加入60%乙醇40mL，超声提取20min，冷却至室温后过滤至100mL量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，作为供试样品溶液。

1.2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品15.42mg，置于50mL量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，摇匀，得浓度为0.3084mg/mL的芦丁对照品溶液。

1.2.1.3 测定波长的选择 取适量供试品溶液和对照品溶液适量，置于25mL量瓶中，先加50g/L的亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀后放置6min，再加入100g/L的硝酸铝溶液1.0mL，摇匀后放置6min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液10mL，加50%乙醇定容到刻度，放置15min，即得。用紫外－可见分光光度计进行扫描，结果两者均在500nm处有最大吸收，故选择500nm作为测定波长。

1.2.1.4 线性关系考察 精密量取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分别置于25mL容量瓶中，依1.2.1.3项下“先加50g/L的亚硝酸钠溶液1.0mL，…”操作，于500nm处测吸收度，以吸收度A为纵坐标、浓度C为横坐标，得回归方程为A=11.741C－0.006，r= 0.9999。结果表明:芦丁对照品在浓度 0.0123～0.0740mg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.2.1.5 精密度实验 精密量取芦丁对照品溶液适量，依 1.2.1.3项下“先加50g/L的亚硝酸钠溶液1.0mL，…”操作，于500nm处连续6次测定吸光度，结果其吸光度的RSD为0.06%，表明精密度良好。

1.2.1.6 重复性实验 精密称取同一批号供试品约1g，平行6份，按1.2.1.1项下供试品制备方法制备样品，测定其含量。结果平均含量为3.2415%，RSD为0.84%，表明该方法的重复性较好。

1.2.1.7 稳定性实验 取同一份供试品溶液适量，分别在显色后0、15、30、45、60、90、120min时测定其吸光度，结果其吸光度的RSD为1.01%，表明供试品在120min内是稳定的。

1.2.1.8 加样回收率实验 取同一供试品约0.5g，平行6份，精密称定，分别加入相应量的芦丁对照品，按1.2.1.1项下供试品制备方法制备样品，测定其含量，计算回收率，结果其平均回收率为96.39%，RSD为0.97%。结果见表1。

表1 加样回收率实验结果(n=6)Table 1 The recovery of total flavonoids(n=6)

1.2.1.9 样品的测定 取供试品溶液适量，分别置于25mL容量瓶中，依1.2.1.3项下“先加50g/L的亚硝酸钠溶液1.0mL，…”操作，于500nm处测吸收度，代入公式计算:

其中，C为代入标准曲线计算得到的提取液总黄酮含量(mg/mL)，V1为测定用提取液体积(mL)，V2为样品提取液总体积(mL)，M为样品重量(g)。

1.2.2 檀香叶总黄酮提取工艺优化

1.2.2.1 单因素考察 选取乙醇浓度、提取时间、料液比为考察因素，分别以其中一个因素为变量，固定其他因素，考察不同因素的不同水平对总黄酮含量的影响，选定不同因素的水平。

1.2.2.2 正交实验 为寻求最佳工艺提取条件组合，在单因素考察的基础上，选择乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)、提取时间(D)四个因素为考察因素，每个因素选择3个水平，以总黄酮含量为指标，采用了L9(34)正交实验表安排实验，并确立因素水平表，见表2。

表2 实验因素水平表Table 2 Factors and levels of experimental

2 结果与分析

2.1 单因素考察

2.1.1 乙醇浓度的考察 取檀香叶粉末5份，每份约1g，精密称定，分别加入浓度为10%、30%、50%、70%、90%乙醇40mL，超声30min，冷却至室温后过滤，用对应浓度的乙醇定容至100mL，测定总黄酮含量，结果见图1。从图1可以看出，当乙醇浓度50%时，总黄酮含量最高。

图1 乙醇浓度对总黄酮含量的影响Fig.1 The study of ethanol concentration

2.1.2 提取时间的考察 取檀香叶粉末6份，每份约1g，精密称定，加入50%乙醇40mL，分别超声提取15、30、45、60、75、90min，冷却至室温后过滤，保存滤液，用50%乙醇定容至100mL，测定总黄酮含量，结果见图2。从图2可以看出提取时间为30min时，总黄酮含量最高。

2.1.3 料液比的考察 取檀香叶粉末，每份约1g，精密称定，按料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入50%乙醇，超声提取30min，滤过，滤液置于100mL容量瓶中，用50%乙醇定容置刻度，测定总黄酮含量结果见图3。从图3可以看出，料液比为1∶50时，总黄酮含量最高。

2.2 正交实验

正交实验结果及方差分析见表3和表4。

由表3和表4可知，四个因素对总黄酮提取率的影响大小的次序为:乙醇浓度＞提取次数＞料液比＞提取时间，两个表的结果一致。由表3的极差结果可知，总黄酮提取率最高的工艺应为A3B2C2D3，即用60%乙醇提取，提取时间为30min，料液比为1∶50，提取次数为3次。但是由表4方差分析可知，乙醇浓度对提取率有显著性影响，提取时间、料液比和次数对提取率没有显著性影响。从节约生产时间和适用于工业生产的角度，故而选择工艺A3B1C1D1，即用60%乙醇提取，提取时间20min，料液比1∶40，提取次数1次。

图2 提取时间对总黄酮含量的影响Fig.2 The study of extracting time

图3 料液比对总黄酮含量的影响Fig.3 The study of the ratio of material and solvent

表3 正交实验结果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 方差分析Table 4 Results of variance analysis

2.3 验证实验

取样品粉末平行三份，按A3B1C1D1的条件制备样品，测定总黄酮含量，结果三份样品的总黄酮含量平均值为3.24%，RSD为0.84%，与正交实验中提取率最高的工艺A3B2C1D3的含量3.46%相比，提取率较为接近。表明该提取工艺稳定、合理，方案可行。

3 结论与讨论

3.1 本实验考察了乙醇浓度、提取时间和料液比三个单因素对提总黄酮提取率的影响，而关于提取次数，多数文献［4－7］均在正交实验中设计为1、2、3次，因此不需要对提取次数进行单因素考察。

3.2 超声波提取法近年来已经越来越多的运用到中药的提取中，相比于传统的提取方法，具有速度快、提取效率高、简便易行等优点［8－9］。本文采用超声技术提取檀香叶中总黄酮，研究结果表明，最佳提取工艺条件为:用60%乙醇提取，提取时间20min，料液比1∶40，提取次数1次，在此提取条件下檀香叶总黄酮含量为3.24%，较为稳定、合理，可行性较高，适合于檀香叶总黄酮的工业生产。

［1］颜仁梁，林励.檀香的研究进展［J］.中药新药与临床药理，2003，14(3):218－220.

［2］颜仁梁，刘志刚，林励.檀香化学成分研究进展［J］.中药材，2006，29(4):337－338.

［3］文海涛，赵红英，林励，等.乙烯利刺激对檀香叶中总黄酮含量的影响［J］.广州中医药大学学报，2010，27(2):156－158.

［4］马俊鹏，韩海霞，郭喜红，等.正交实验优选啤酒花总黄酮提取工艺［J］.中国药房，2010，21(11):994－996.

［5］杨志芳，王维娜，杨坤，等.正交设计优选罗布麻叶中总黄酮提取工艺［J］.中草药，2006，37(8):1177－1178.

［6］冯卫生，赵献敏，王彦志，等.正交设计优化卷柏叶中总黄酮提取工艺［J］.中草药，2009，40(6):893－896.

［7］苏志伟，田鹤，马英丽，等.金莲花中总黄酮提取工艺的研究［J］.中草药，2007，38(6):850－851.

［8］赵佳，霍俊伟.蓝果忍冬总黄酮提取工艺研究［J］.食品工业科技，2010，31(11):242－244.

［9］陈海光，黄敏，于立梅.青皮竹叶黄酮工艺的研究［J］.食品工业科技，2010，31(9):245－247.

Optimization of the extraction technology of total flavonoids from leaves of Santalum album L.by orthogonal experiment

YU Wen－xin1，ZHUANG Man－xian2，LIN Li2，*，DENG Rui－yun2，PENG Li－shi2LI Li－yue2
(1.Department of Pharmacy，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China; 2.Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China)

The extraction technology of total flavonoids from Leaves of Santalum album L.was optimized by orthogonal experiment with the content of total flavonoids as index and with ethanol concentration，extracting time，the ratio of raw materials to solvent and extracting frequency as factors.The influences of factors to different degree with an order of ethanol concentration，extracting frequency，the ratio of raw materials to solvent，extracting time. The optimal extraction technology was as follow:the concentration of ethanol was 60%，the extracting time was 20min，the ratio of raw materials to solvent was 1∶40 and extracting frequency was 1 time.The extraction technology was steady for the extraction of total flavonoids from Leaves of Santalum album L.，and the content of otal flavonoids from Leaves of Santalum album L.was 3.24%

leaves of Santalum album L.;total flavonoids;orthogonal experiment;extraction technology

TS201.2

B

1002－0306(2012)08－0284－03

名贵中药檀香为檀香科植物檀香 Santalum album L.的树干心材，具有理气温中、开胃止痛之功效［1］。檀香原产印度、印尼、马来西亚等地，作为一种集药用、香料、工艺雕刻材料于一身的经济植物，被誉为绿色的金子［2］。檀香药材一般需30年左右才能供药用［1］。因此，对该药用树种进行综合利用研究，以提高其短期经济效益，已成为檀香生产发展的关键环节之一。目前，檀香叶已经被加以综合开发利用，并已开发成茶叶等保健食品。前期研究表明，檀香叶含有较丰富的黄酮类成分［3］，但未见关于檀香叶中总黄酮提取工艺的研究，因此，本研究通过优化檀香叶总黄酮的提取工艺，为其质量控制及总黄酮的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2011－07－25 *通讯联系人

余文新(1976－)，男，主管中药师，研究方向:常用中药的有效成分。

高等学校博士学科点专项科研基金(20094425110009);国家工信部中药材扶持项目(2009060)。