蜜环菌水溶性多糖的抗氧化活性研究

朱显峰，余晨晨，范书军，秦仁炳，张晶晶

（河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封475004）

蜜环菌水溶性多糖的抗氧化活性研究

朱显峰，余晨晨，范书军，秦仁炳，张晶晶

（河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封475004）

目的：通过蜜环菌水溶性多糖对·OH、O2－·和DPPH·三种自由基清除作用，评价其抗氧化性能，为蜜环菌药物制剂的活性研究及其产品的质量检测标准提供重要参考。方法：经热水浸提、除蛋白等步骤分离纯化到水溶性多糖，以抗坏血酸和TBHQ为对照，采用分光光度法评定其抗氧化特性。结果：蜜环菌水溶性多糖对三种自由基均有不同程度的清除活性，对三种自由基的清除能力是DPPH·>·OH>O2－·，当清除率达到90%以上时，清除DPPH·、·OH和O2－·的所需的多糖浓度分别为1.0、5.0、6.0mg·mL-1，蜜环菌多糖的清除能力显著。结论：蜜环菌水溶性多糖在体外具有较明显的抗氧化活性，在实验浓度范围内，抗氧化效果与浓度呈显著的线性相关。作为一种重要的天然活性物质，蜜环菌多糖的抗氧化活性和抗衰老作用将具有较高的应用价值。

蜜环菌，水溶性多糖，抗氧化，自由基

蜜环菌（Armillaria mellea）是一种与天麻共生的药食两用真菌，其产品制剂是治疗头痛、眩晕、神经衰弱的有效药物，蜜环菌深层发酵产物中富含嘌呤类化合物、必需氨基酸、蜜环菌多糖和倍半萜类化合物等多种有效成分，这些天然活性物质具有较强的神经调节、镇痉熄风、增智健脑和延缓衰老等药理作用，并可提高机体免疫功能。蜜环菌多糖作为主要的活性成分，对其抗氧化作用的分析，为有效评价蜜环菌多糖的抗衰老功能提供重要参考[1-2]。为此，我们提取了蜜环菌菌粉的水溶性多糖，通过与抗坏血酸、TBHQ的对比，对其清除羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基能力进行了系统研究。对提高蜜环菌药品疗效、开展蜜环菌产品制剂的质量标准研究和促进蜜环菌多糖类产品的开发与应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

邻苯三酚、三羟甲基胺基甲烷（Tris） 上海国药集团化学试剂有限公司；水杨酸 天津市大茂化学试剂厂；硫酸亚铁、双氧水（H2O2） 天津市德思化学试剂有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） Sigma公司；抗坏血酸 天津市科密欧化学试剂开发中心；特丁基对苯二酚（TBHQ） Alfa Aesar公司，以上均为分析纯试剂；蜜环菌菌粉 由河南龙都药业有限公司提供。

TU-1201紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蜜环菌水溶性多糖的提取与纯化 称取5g蜜环菌菌粉用50mL蒸馏水80℃水浴3h后，离心，剩余物再加入50mL蒸馏水，继续水浴2h，合并滤液旋转蒸发至原体积1/5。加入三倍体积的95%乙醇沉淀24h，4000r/min离心得粗多糖。粗多糖依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗3次，干燥。沉淀用蒸馏水80℃水浴下充分溶解，离心得上清液。上清液用Sevage法除蛋白，按其体积的1/5加入Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），4000r/min离心15min，除去中间变性蛋白和溶剂层，重复操作4次以上，直至除尽蛋白质。将除完蛋白质的上清液减压浓缩至1/3，加入3倍体积95%乙醇沉淀24h，沉淀再次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗3次，40℃下真空干燥8h得供试样品[3]。

1.2.2 标准曲线的制备与粗多糖含量的测定 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖25mg，置250mL容量瓶中，定容。分别精密吸取以上标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至干燥的具塞试管中，补水至2mL。加入5%苯酚溶液1mL和5mL浓硫酸迅速反应，冷却至室温。以相应空白试剂为对照，在490nm下测定吸光度，绘制标准曲线，以校正系数0.9校正多糖mg数。

称量从5g菌粉中所提取到的蜜环菌多糖的干重，按苯酚-硫酸法测定粗多糖水溶液的多糖含量[4]。多糖得率（mg·g-1）=总糖质量/蜜环菌菌粉质量。

1.2.3 蜜环菌水溶性多糖的紫外-可见吸收光谱图 分离纯化后的多糖适量溶于蒸馏水中，用紫外-可见分光光度计在200～700nm范围内进行检测。

1.2.4 清除羟基自由基（·OH）活性的测定 利用H2O2与Fe2+混合反应产生·OH，在体系内加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510nm下有最大吸收。反应体系中含8.8mmol·L-1的H2O21mL，9mmol·L-1的FeSO41mL，9mmol·L-1的水杨酸-乙醇溶液1mL和不同浓度的多糖溶液各1mL，蒸馏水为参比。其中，H2O2最后加入并启动整个体系，37℃反应30min。以抗坏血酸、TBHQ作为对照组，每个浓度重复三次，取其吸光度的平均值[5-6]。

式中：A0为加入FeSO4、水杨酸、H2O2，不加入多糖溶液的吸光度值；AX为加入FeSO4、水杨酸、H2O2、多糖溶液的吸光度值；AX0为加入FeSO4、水杨酸、多糖溶液，不加H2O2的吸光度值。

1.2.5 清除超氧阴离子（O2－·）能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法。取0.05mol·L-1pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL于试管中，放入25℃水浴中保温10min，加入不同浓度的多糖溶液1mL，混匀后加入0.4mL 6mmol·L-1的邻苯三酚（以10mmol·L-1的HCl配制），计时4min，加入8mol·L-1的HCl溶液1.0mL终止反应，每个浓度重复三次。以抗坏血酸、TBHQ作为对照组，320nm下测其吸光值[7]。

式中：A0为用水代替多糖时测得的吸光值；Ai为不同多糖浓度下测得的吸光值；Aj为用水代替邻苯三酚时不同多糖浓度下测得的吸光值。

1.2.6 清除DPPH自由基能力的测定 利用DPPH溶液的特征紫红色吸收峰，加入抗氧化剂或多糖溶液后吸光值的下降表示其对自由基的清除能力。DPPH用甲醇配制成0.2mmol·L-1，取2mL此溶液与2mL不同浓度的多糖溶液暗室中反应30min，每个浓度重复三次。以抗坏血酸、TBHQ作为对照组，517nm下测定其吸光值[8-9]。

式中：A0为加入2mL DPPH和2mL甲醇测得的吸光值；Ai为加入2mL DPPH和2mL多糖溶液测得的吸光值；Aj为加入2mL多糖溶液和2mL甲醇测得的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

本实验绘制的葡萄糖标准曲线回归方程Y= 0.03448+7.23714X，r=0.99399。表明葡萄糖在0.02～0.1g·L-1呈良好的线性关系。

本实验所得到的蜜环菌水溶性粗多糖，多糖得率为28.16mg·g-1（干重）。

2.2 蜜环菌水溶性多糖的紫外-可见吸收光谱图

紫外光谱分析结果表明紫外吸收谱在200nm处有一吸收峰，无明显核酸、蛋白类物质及其他杂质的特征吸收峰。结果见图1。

图1 蜜环菌多糖的紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV visible absorption spectrum of Armillaria mellea polysaccharide

2.3 蜜环菌多糖对·OH的清除作用

测定浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg·mL-1的粗多糖水溶液、抗坏血酸、TBHQ溶液对羟基自由基的清除作用，结果见图2。

由图1可知，随着溶液浓度的增大，蜜环菌多糖、抗坏血酸和TBHQ的清除效果也得到进一步的提高，对照抗坏血酸和TBHQ的清除能力相当，浓度为0.2mg·mL-1时两者的清除率均达到50%左右。蜜环菌多糖在5mg·mL-1浓度下对羟基自由基的清除率达到100%，低浓度0.1mg·mL-1仍有21.98%的清除作用，清除效果明显。

图2 蜜环菌多糖、TBHQ和抗坏血酸对·OH的清除效果Fig.2 Removed effect of Armillaria mellea，TBHQ and ascorbic acid on·OH

2.4 蜜环菌多糖对O2－·的清除作用

测定浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg·mL-1的粗多糖水溶液、抗坏血酸和TBHQ溶液对超氧阴离子的清除作用，结果见图3。

结果表明，蜜环菌多糖对O2－·的清除作用较弱，在浓度为1.0mg·mL-1时清除率只有2.49%，当浓度增加到6mg·mL-1时，清除率可达到97.34%。随着浓度的增大，显示出了一定的清除活性。蜜环菌多糖对超氧阴离子的清除能力要优于化学合成的抗氧化剂TBHQ，但与对照抗坏血酸相比，两者之间的清除效果相差较大。

图3 蜜环菌多糖、TBHQ和抗坏血酸对O2-·的清除效果Fig.3 Removed effect of Armillaria mellea，TBHQ and ascorbic acid on O2－·

2.5 蜜环菌多糖对DPPH自由基的清除作用

选取0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的粗多糖水溶液和0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的抗坏血酸和TBHQ溶液，测定其对DPPH自由基的清除作用，结果见图4。

蜜环菌多糖对DPPH自由基有较强的清除作用，随着多糖浓度的增加清除效果逐渐加强，在一定浓度范围内呈量效关系，在1mg·mL-1时清除率为90.52%，且在低浓度下仍保持一定的清除活性。清除DPPH自由基所需的多糖浓度远低于其他两种自由基。

图4 蜜环菌多糖、TBHQ和抗坏血酸对DPPH·的清除效果Fig.4 Removed effect of Armillaria mellea，TBHQ and ascorbic acid on DPPH·

3 讨论

自由基是机体氧化反应中产生的副产物，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。一般来说，机体内的抗氧化系统可维持自身的自由基平衡，可一旦受到一些不可抗的外界因素如机体病变、辐射等影响，就会打破这种平衡，造成机体的损伤与疾病的发生。因此，从真菌中提取安全高效的多糖作为一种天然抗氧化剂，为蜜环菌多糖的开发和应用提供一定的理论依据。

本实验选择天然抗氧化剂抗坏血酸和合成的抗氧化剂TBHQ作为对照，通过三者之间抗氧化作用的比较，探讨了蜜环菌水溶性多糖对·OH、O2－·和DPPH·三种自由基的清除能力。虽然在清除·OH和DPPH自由基的能力上低于两个对照，但在一定测试浓度范围内，蜜环菌多糖仍显示出了很高的抗氧化能力。

结果表明，从蜜环菌粉中提取出的水溶性多糖表现出较强的抗氧化活性，而这可能是它防衰老、抗炎症、降血脂等功效的药理基础。多糖的抗氧化性能作为一项重要的生理活性指标，为完善蜜环菌药品及其相关产品的质量检测标准提供科学的依据。

4 结论

经深层发酵、浓缩干燥而得到的蜜环菌菌粉，其水溶性多糖对三种自由基的清除能力有较大差异，以清除能力来比较DPPH·>·OH>O2－·，对DPPH·的清除效果要明显优于其他两种自由基。在清除率达到50%时，多糖对·OH、O2－·和DPPH自由基的清除浓度大约为1.5、3.5、0.5mg·mL-1。

本实验通过三种不同的体外抗氧化体系证明了蜜环菌水溶性多糖的自由基清除能力，为我们更进一步准确认识蜜环菌多糖类活性物质的功效和开展蜜环菌产品制剂的质量标准研究提供重要参考。

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Study on antioxidant activity of water soluble polysaccharide from Armillaria mellea

ZHU Xian-feng，YU Chen-chen，FAN Shu-jun，QIN Ren-bing，ZHANG Jing-jing
（Institute of Bioengineering and College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475004，China）

Objective：The Scavenging effect evaluated the antioxidant activities of the water soluble polysaccharide from Armillaria mellea on hydroxyl（·OH），superoxide anion（O2－·）and 1，1-Dipheny-2-picrylhydrazyl（DPPH）radicals.It provided important reference for activity study and quality standards of Armillaria mellea’s products. Methods：The experiment got the pure polysaccharide by extracted in hot water and removed proteins and other steps.With ascorbic acid and TBHQ as controls，spectrophotometry was used to assess the antioxidant properties.Results：The water soluble polysaccharide had different scavenging abilities on hydroxyl，superoxide anion and DPPH radicals.The scavenging effect of radicals was DPPH>·OH>O2－·.When the scavenging percentage of hydroxyl，superoxide anion and DPPH radicals reached 90%，the polysaccharide concentration was 1.0，5.0，6.0mg·mL-1，respectively.The scavenging ability of polysaccharide was significant.Conclusion：The water soluble polysaccharide had the capable of clear radicals in vitro and exhibited obvious antioxidant activity.In the experimental concentration range，their antioxidant effects showed positive correlation with polysaccharide concentration.Therefore，as an important active substances in nature，the antioxidant activity and anti-aging effects of polysaccharide will have a highly value of application.

Armillaria mellea；water soluble polysaccharide；antioxidant；radical

TS201.1

A

1002-0306（2012）03-0089-04

2010－12－30

朱显峰（1973－），男，博士，副教授，主要从事微生物与生化药学的研究。

河南省科技攻关计划项目（102102310016）；河南省高校青年骨干教师资助计划项目。