梅片树叶挥发油和天然右旋龙脑的抑菌性能研究

吴少云，苏健裕，石 磊，，李 琳

（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

梅片树叶挥发油和天然右旋龙脑的抑菌性能研究

吴少云1，苏健裕2，*，石 磊1，2，李 琳2

（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640）

目的：研究梅片树叶挥发油、天然右旋龙脑的体外抗菌性能。方法：采用K-B纸片琼脂扩散法测定梅片树叶挥发油、天然右旋龙脑和合成龙脑对细菌、植物病原真菌和动物源真菌的抑菌圈大小，并采用琼脂稀释法测定其最小抑菌浓度（MIC值）。结果：梅片树叶挥发油、天然右旋龙脑和合成龙脑有不同程度的抑菌作用，天然右旋龙脑和合成龙脑抑菌作用相似，梅片树叶挥发油的抑菌效果比较明显。结论：梅片树叶挥发油和天然右旋龙脑均有一定的抑菌活性，具有广阔的开发利用前景。

梅片树叶挥发油，天然右旋龙脑，抑菌性能

龙脑是一种高级香料和重要的化工原料，按来源不同可以分为3种[1]：左旋龙脑（L-borneol），俗称艾片，主要是从菊科多年生草本植物艾纳香（Blumea balsamifera DC.）叶提取的结晶；天然右旋龙脑（D-borneol），又称梅片、天然冰片，主要来源于龙脑香科植物龙脑香树（Dryobalanops aromatica Gaertn.f.）树脂中析出的天然结晶性化合物；合成龙脑，俗称“机制冰片”，是由松节油、樟脑等经化学方法合成，是消旋龙脑和异龙脑的混合物。近年研究表明合成龙脑的质量不稳定[2]，某些在售产品中含有毒性樟脑的相对含量可达45%以上，有的甚至达到97%，而且主要成分可随储藏时间延长而发生变化[3]。所以，天然右旋龙脑逐步取代合成龙脑是必然的趋势[4]。天然右旋龙脑原产于印度尼西亚苏门答腊群岛，它是从龙脑香树干的树脂蒸馏而得的天然产品，我国一直以来依靠进口满足需要[5]。但是目前由于当地长期以来过度采伐，自然资源破坏严重，该地龙脑香树已近枯竭；加之当地政府已经禁止伐树取脑，天然右旋龙脑奇缺，我国已经不可能依靠进口来满足需要，对整个中医药行业造成了严重的影响[6-7]。20世纪80年代，中国科学院华南植物研究所在广东梅州地区的樟科阴香化学型—梅片树枝叶中提取得到了天然右旋龙脑[7-8]。本文作者利用GC-MS分析对梅片树枝叶龙脑粗油成分进行了首次分析，共获得了40种成分，其中天然右旋龙脑相对含量达到了78.4%[9]。然而，目前尚未对梅片树叶提取物的抗菌活性进行研究报道。本文通过对梅片树叶挥发油及从挥发油结晶的天然右旋龙脑进行体外抗菌研究，以期对梅片树的应用开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

梅片树叶挥发油 从梅片树叶中提取得到；天然右旋龙脑 从梅片树挥发油中升华结晶得到，广东嘉应制药股份有限公司；合成龙脑 广州黄埔化工有限公司；庆大霉素药敏纸片（10μg/片） 北京天坛药物生物技术开发公司；硫酸庆大霉素（Sigma分装） 北京普博欣生物科技有限公司；二甲基亚砜、水解酪蛋白琼脂培养基（MHA）、沙氏琼脂培养基（SDA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDB）、脑-心浸萃液态培养基 广州环凯微生物科技有限公司；琼脂 广州国奥生物技术有限公司；氯化钠 国药集团化学试剂有限公司，分析纯；细菌：金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）ATCC29213，铜绿假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）ATCC27853，沙门氏菌（Salmonella）ATCC14128，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115，大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922，白色念珠菌（Moniliaalbican）ATCC11006 由河北省疾控中心提供；植物病原真菌：水稻稻瘟病菌（Pyricu laria oryzae Cav.），松赤枯病菌（Pesta lotia funereal），玉米纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kuha） 由中国科学院华南植物研究所惠赠；动物源真菌：须毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes），犬小孢子菌（Microsporum canis），石膏小孢子菌（Microsporum gypseum） 由广东省农业科学院畜牧研究所惠赠。

1.2 实验方法

1.2.1 梅片树叶挥发油的提取[9]将新鲜梅片树叶粉碎，按《中国药典》（2005版）附录XD的水蒸气蒸馏法提取挥发油。收集蒸馏的馏出物，向其中投入过量无水硫酸钠并充分振荡。使用循环水式真空泵抽滤此混合物得到不含水分的龙脑粗油（黄色透明油状物）。

1.2.2 菌悬液的制备 挑取1～2个菌落于生理盐水，校正至0.5麦氏标准浊度（该管为0.048mol/L的BaCl2，即150g/L BaCl20.5mL加0.18mmol/L H2SO499.5mL，相当于10cfu/mL）。

1.2.3 抗菌药物的配制

1.2.3.1 庆大霉素的配制 用无菌水溶解庆大霉素并配制药品浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL 6个浓度。

1.2.3.2 天然右旋龙脑和合成龙脑的配制（测抑菌圈）分别用100%DMSO 1mL溶解1.5g天然右旋龙脑和合成龙脑，混匀成透明状，备用。（测MIC值）用100%DMSO分别溶解天然右旋龙脑和合成龙脑并配制药品浓度为50、40、30、20、15、10、5、2.5mg/mL 8个浓度。

1.2.3.3 挥发油的配制 用100%DMSO稀释挥发油，浓度为16%、8%、4%、2%、1%、0.5%6个浓度。

1.2.4 K-B纸片琼脂扩散法抑菌实验[10]将菌悬液0.1mL滴入培养基（细菌采用MHA、植物病原真菌采用SDA、动物源真菌采用PDB）涂布均匀即成含菌平板，加盖室温下放置3min。将10μL龙脑、10μL合成龙脑、10μL挥发油、10μL DMSO、10μL无菌水分别滴加在6mm的滤纸片上，在无菌条件下将其贴在各种含菌平板上，并贴上庆大霉素药敏纸片作为对照。15min内将平板放置37℃培养箱培养24h后，取出平板，用游标卡尺测量抑菌圈直径，实验重复三次。

1.2.5 最小抑菌浓度（MinimalInhibitionConcentration，MIC）的测定（琼脂稀释法）[10]分别吸取上述8个浓度的天然右旋龙脑、合成龙脑和6个浓度的挥发油、庆大霉素药液2mL于培养皿中，每皿再加入18mL培养基，摇匀，静置凝固后，每皿分别点上三类菌悬液各2μL。并以不加药液的平板和含有10%DMSO的平板点上菌液作为对照。待菌液干后将平板放置37℃培养箱培养20h，以不长菌的药品最低浓度为该药品的MIC值，实验重复三次。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈大小的测定

三类菌株的抑菌圈测定结果见表1。从结果可看出，天然右旋龙脑和合成龙脑的抑菌效果相似，对单增李斯特菌和沙门氏菌的抑菌作用均不明显，但对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和白色念珠菌有一定的抑菌效果，抑菌活性由强到弱依次为：白色念珠菌>大肠杆菌>铜绿假单胞菌>金黄色葡萄球菌>沙门氏菌>单增李斯特菌。梅片树叶挥发油对各供试菌株均有一定的抑制作用，对白色念珠菌和大肠杆菌的抑菌效果较显著。总体而言，挥发油比龙脑的抑菌效果要显著些。

天然右旋龙脑和合成龙脑对植物病原真菌和动物源真菌的6种菌均有一定的抑菌作用，梅片树叶挥发油对这6种菌的抑制作用也比较显著。由前期研究可知，挥发油中除了龙脑外还含有其它成分具有抑菌作用，如乙酸龙脑酯（3.26%）、斯巴醇（2.60%）和桉叶油素（1.92%）等[8]。倪木兰等[11]研究表明桉叶油对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用。

2.2 MIC值的测定

三类菌株的MIC值测定结果见表2，两个对照平板均长菌，天然右旋龙脑、合成龙脑和梅片树叶挥发油对三类菌株均有抑菌作用。挥发油的MIC值比天然右旋龙脑和合成龙脑小，表明其抑菌作用较为明显。此外，天然右旋龙脑和合成龙脑对植物病原真菌和动物源真菌的MIC值均比细菌的大，而梅片树叶挥发油基本保持不变，表明天然右旋龙脑和合成龙脑抑制细菌的抑菌能力较强，挥发油由于含有多种成分而保持较为广谱的抑菌性能。

表1 三类菌株的抑菌圈大小（mm）Table 1 The inhibition zone of three kinds of strains（mm）

表2 三类菌株的MIC值的测定Table 2 Determination of MIC of three kinds of strains

3 结论

本实验通过采用K-B纸片琼脂扩散法测定梅片树叶挥发油、天然右旋龙脑和合成龙脑对细菌、植物病原真菌和动物源真菌的抑菌圈大小，并采用琼脂稀释法测定最小抑菌浓度，以比较梅片树叶挥发油、天然右旋龙脑和合成龙脑的体外抗菌活性。以上结果表明，天然右旋龙脑、合成龙脑和梅片树挥发油对细菌、植物病原真菌、动物源真菌均有一定的抑菌作用，尤其是对白色念珠菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌作用。天然右旋龙脑和合成龙脑有相似的抑菌效果，但天然右旋龙脑的无毒性与稳定性使其具有更广阔的潜在应用前景；梅片树叶挥发油由于含有多种成分而具有更加广谱的抑菌作用，是一种很有研究价值和开发前景的芳香油植物资源。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：化学工业出版社，2005.

[2]曾池清，何贵峰.十批市售冰片的GC-MS分析[J].中药材，2004，27（5）：347.

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[5]赵守训.冰片（龙脑）：世界最早应用的天然有机成分药物[J].亚太传统医药，2006（2）：24-25.

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[10]管志远，王艾琳，李坚.医学微生物学实验技术[M].北京：化学工业出版社，2005：84.

[11]倪木兰.桉叶油体外抗菌作用的初步实验研究[J].遵义医学院学报，1995，18（3）：178-180.

Study on antibacterial activity of essential oil and D-borneol from leaves of Cinnamomun burmannii B1

WU Shao-yun1，SU Jian-yu2，*，SHI Lei1，2，LI Lin2
（1.School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；2.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

To investigate the antibacterial function of essential oil and D-borneol from leaves of Cinnamomun burmannii B1 in vitro.The K-B disc agar diffusion method was used to mensurate the size of antibacterial zone of essential oil and D-borneol from leaves of Cinnamomun burmannii B1，as well as synthetic borneol.The agar dilution method was used to determine their minimum inhibitory concentrations（MIC）.Essential oil，D-borneol and synthetic borneol had different level of inhibitory effect.D-borneol and synthetic borneol had similar inhibitory effect，and the antibacterial effect of essential oil was more significant.Essential oil and D-borneol showed antibacterial effects on the experimental strains，which exhibited a promising prospect for developing medical products and perfume.

essential oil from Cinnamomun burmannii B1 leaves；D-borneol；antibacterial effect

TS201.2

A

1002-0306（2012）07-0085-03

2011－06－29 *通讯联系人

吴少云（1987-），女，硕士研究生，研究方向：病原微生物学。

广东省自然科学基金博士启动项目（10451064101005160）；省部产学研结合项目（2009A090100041，2010B090500033）；中央高校基本科研业务费专项资金（2011ZM0099）。