罗非鱼尾色素中抗氧化成分的提取及活性研究

段宙位，申铉日，李 鹏，陈秀明，覃柳香

(海南大学食品学院，海南海口570228)

罗非鱼尾色素中抗氧化成分的提取及活性研究

段宙位，申铉日*，李 鹏，陈秀明，覃柳香

(海南大学食品学院，海南海口570228)

为了研究鱼尾色素的抗氧化性，以提取率和DPPH自由基清除率为评价指标，采用溶剂浸提的方法对色素进行提取，利用DPPH法、ABTS法和铁氰化钾还原法对提取物进行抗氧化实验。结果表明，鱼尾色素抗氧化成分提取的较佳工艺为浸提溶剂无水乙醇、温度20℃、料液比(g/mL)1∶5、时间24h、浸提1次;此时色素提取物的提取率达2.40%，DPPH自由基清除率为58.44%。抗氧化性实验表明，鱼尾色素提取物具有较强的清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力，其IC50值为0.3891mg/mL和1.8654mg/mL。

鱼尾，抗氧化，提取，1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼尾 海南省海口市泉溢食品有限公司; 1，1－二苯基－2－三硝基苯肼DPPH Sigma公司; 2，2－联氮－双－(3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸)ABTS上海生工生物有限公司;其它试剂 均为国产分析纯;实验用水 超纯水。

TU－1901型双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;RE52－AA型旋转蒸发器、SHZ－Ⅲ型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂; BS124S型电子天平 Sartorius公司;Alpha1－4lsc型冷冻干燥机 德国Christ公司;85－1型恒温磁力搅拌器 常州澳华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼尾预处理 用冷水(4℃)清洗鱼尾表面杂质待用。

1.2.2 鱼尾色素抗氧化成分提取的单因素实验

1.2.2.1 鱼尾抗氧化成分提取率的计算 将色素抗氧化成分提取液旋转蒸发浓缩(35℃)，再经真空冷冻干燥，得到固体干物质，称重，按下式计算提取率:

1.2.2.2 提取溶剂的选择 取4.00g鱼尾，放入分别盛有40mL甲醇、乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、氯仿∶甲醇∶水=1∶2∶0.8、氯仿∶甲醇∶水=2∶1∶0.8的烧杯中，4℃浸提48h，按1.2.2.1方法计算提取率。配制浓度均为0.5mg/mL的色素溶液，按 1.2.4.1方法测定其对DPPH自由基的清除率。

1.2.2.3 提取溶剂体积分数的选择 取4.00g鱼尾，放入分别盛有40mL体积分数分别为10%、30%、50%、70%、90%乙醇和无水乙醇中，4℃浸提48h，按1.2.2.1方法计算提取率。配制浓度均为0.5mg/mL的色素溶液，按1.2.4.1方法测定其对DPPH自由基的清除率。

1.2.2.4 提取温度的选择 取4.00g鱼尾，放入分别盛有40mL无水乙醇的烧杯中，分别于4、8、12、16、20、24℃水浴浸提48h，按1.2.2.1方法计算提取率。配制浓度均为0.5mg/mL的色素溶液，按1.2.4.1方法测定其对DPPH自由基的清除率。

1.2.2.5 料液比的选择 取4.00g鱼尾，分别加入12、20、40、60、80mL的无水乙醇溶液，在20℃条件下浸提48h，按1.2.2.1方法计算提取率。配制浓度均为0.5mg/mL的色素溶液，按 1.2.4.1方法测定其对DPPH自由基的清除率。

1.2.2.6 提取时间的选择 取4.00g鱼尾，加入20mL的无水乙醇，在20℃条件下分别浸提12、24、36、48、60h，按 1.2.2.1方法计算提取率。配制浓度均为0.5mg/mL的色素溶液，按 1.2.4.1方法测定其对DPPH自由基的清除率。

1.2.2.7 提取次数的选择 取4.00g鱼尾，加入20mL的无水乙醇，在20℃条件下分别浸提24h，提取次数超过两次，合并提取液，按1.2.2.1方法计算提取率。配制浓度均为0.5mg/mL的色素溶液，按1.2.4.1方法测定其对DPPH自由基的清除率。

1.2.3 正交实验 在单因素实验的基础上，运用L9(33)正交表，以鱼尾色素提取物的提取率与清除率为指标，选择温度、料液比、时间进行三因素三水平正交实验，因素水平设计见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels for the orthogonal design

1.2.4 抗氧化实验

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的测定［8－10］取2mL不同浓度的样品溶液，加入 2mL 6.5×10－5mol/L DPPH溶液，混合后在室温下避光反应30min，以95%乙醇调零，在517nm处测其吸光度Ai;同时测定2mL 95%乙醇与2mL样品溶液混合后的吸光度Aj以及2mL DPPH溶液与2mL 95%乙醇混合后的吸光度A0。

自由基清除率(%)=(1－(Ai－Aj)/A0)×100% 1.2.4.2 清除 ABTS+自由基的测定［11－12］取5.0mL 7mmol/L的ABTS溶液，加入88.0μL 140mmol/L的过硫酸钾，在室温下置于暗处反应12～16h，形成ABTS+自由基储备液。在734nm处，用体积分数为70%的乙醇将ABTS自由基储备液稀至吸光度为0.70±0.02，备用。准确量取0.1mL不同浓度(1、2、3、4、5mg/mL)的样品溶液，加入3.9mL ABTS+溶液，混匀，在室温下反应6min，于734nm处测定吸光度(AE)。同时吸取3.9mL ABTS+溶液，加入0.1mL 70%的乙醇溶液于734nm处测定吸光度(AB)。ABTS自由基清除率按下式计算:

ABTS自由基清除率(%)=(1－(AB－AE)/ AB)×100%

式中:AB空白样吸光度;AE为试样吸光度。

1.2.4.3 还原力的测定［13］在2.5mL pH6.6的磷酸盐缓冲液中加入不同浓度(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8mg/mL)的样品液2.5mL，1%的铁氰化钾溶液2.5mL，混合均匀后在50℃恒温20min，冷却，再加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min离心分离10min，取上层清液5mL，加蒸馏水5mL和0.1% FeCl3溶液1mL，在700nm处测定吸光度。吸光度越高，还原能力越强。

2 结果与分析

2.1 鱼尾色素中抗氧化成分提取工艺研究

2.1.1 提取溶剂的选择 由表2可知，随着提取剂极性增加，色素抗氧化成分的提取率及其对自由基的清除率基本呈上升趋势，说明鱼尾色素中的抗氧化成分较易溶于极性较大的溶剂中。在以氯仿、甲醇、水的混合溶剂为提取剂时，色素的提取率高于其它提取溶剂，但其对自由基的清除率较乙醇低，且氯仿，甲醇毒性较乙醇大，考虑到自由基清除率、安全性、成本等因素，选择无水乙醇作为提取溶剂。

2.1.2 提取溶剂体积分数的选择 由图1可知，当乙醇溶液体积分数增大时，色素的提取率及其对自由基的清除率随之上升。这是可能是鱼类色素主要由黑色素(黑色)、类胡萝卜素(红、黄等鲜艳的颜色)及嘌呤类物质(银白色)组成［13］，黑色素不溶于有机溶剂，嘌呤类物质不具有抗氧化性，鱼尾色素中的抗氧化成分应以类胡萝卜素存在为主，而类胡萝卜素又以脂溶性形式存在，由此表现出脂溶性溶剂提取率、清除率较高，因此选择无水乙醇作为提取溶剂为宜。

2.1.3 提取温度的选择 由图2可知，鱼尾色素中活性成分的提取率随温度升高而增大，清除率略有降低，这可能是因为温度升高色素的溶出增多，但对色素中抗氧化成分的结构具有一定的破坏作用。综合

考虑提取率、清除率及鱼尾的再利用(提取高分子胶原蛋白，高分子胶原蛋白的变性温度约为28℃)因素，提取温度选择20℃左右较为适宜。

表2 溶剂对色素提取率与自由基清除率的影响Table 2 Effect of different solvents on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

图1 乙醇体积分数对色素提取率与清除率的影响Fig.1 Effect of different concentration on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

图2 温度对色素提取率与清除率的影响Fig.2 Effect of different temperatures on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

2.1.4 料液比的选择 由图3可知，随着料液比的减小，色素中抗氧化成分的提取率增大。当料液比(g/mL)低于1∶5时，提取率增加不明显，这可能是料液比1∶5，色素的溶出基本达到平衡;当料液比小于1∶5时，提取率稍有增加，清除率略有降低，这可能是色素的溶出虽然增加，但抗氧化成分的溶出并未增加，同样浓度的色素溶液，抗氧化成分的比例减少，清除率降低。料液比越小，溶剂的用量越大，考虑到清除率与成本因素，料液比选择1∶5左右为宜。

2.1.5 提取时间的选择 由图4可知，随着提取时间的延长，提取率随之增加，当时间大于24h时，提取率增加趋势变缓，清除率略有降低。这可能是时间增加，色素的溶出增多，但色素抗氧化成分在较长的时间里结构发生轻微变化，清除自由基能力略有降低，因此，提取时间选择24h左右为宜。

2.1.6 提取次数的选择 由表3可知，随着提取次数的增加，提取率稍有增加，清除率变化不明显。考虑到增加提取次数会增加成本与延长实验周期，选择提取1次较为适宜。

图3 料液比对色素提取率与自由基清除率的影响Fig.3 Effect of different elution liquid ratio on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

图4 提取时间对色素提取率与自由基清除率的影响Fig.4 Effect of time on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

表3 浸提次数对色素提取率与自由基清除率的影响Table 3 Effect of the extraction times on the extraction rate of pigment and the removal rate of free radical

2.1.7 正交实验 由表4可知，各因素对鱼尾色素提取物提取率的影响次序为C＞B＞A，即时间＞料液比＞温度。最优水平为A3B2C2。这可能是温度升高分子的运动加快，渗透和扩散速度加快;料液比减小液料的浓度差增大，分子的扩散速度加快;时间影响分子扩散体积，在较低温度条件下，分子运动剧烈程度对色素扩散速度的影响不及料液比产生的浓度差，在较低扩散速度条件下，大量增加时间，对提高提取率作用显著。各因素对DPPH自由基清除率的影响次数为C＞A＞B，即时间＞温度＞料液比，最优水平A2B3C2。这可能是在较低温度条件下，色素提取物较稳定，清除DPPH自由基能力主要受提取物中抗氧化成分所占比例的影响。由表4中极差值可知，各因素对清除率的影响的差异性相差不大，对提取率影响的差异性较大，这是因为色素提取物的抗氧化性主要受提取溶剂的影响，同种溶剂在不同条件下提取色素，主要会影响色素的溶出。因为2个指标独立分析后得出的最佳提取条件不同，需要对各个指标的主次顺序进行综合考虑以确定最后的最佳工艺。由于本实验的研究重点为产物的抗氧化性，即以DPPH自由基的清除率为主要考察指标，提取率对生产成本控制具有一定的参考价值。温度对清除率影响较大，对提取率影响较小，水平A2与A3提取率仅相差0.013%，为保证清除率，温度选择A2较佳。料液比对清除率影响最小，水平B2与B3仅相差0.032%，对提取率影响较大，考虑到成本、提取率因素，料液比选择B2最佳，时间均为C2最佳。

表4 正交实验设计及结果Table 4 Designs and results of orthogonal test

故根据正交实验结果，在选定的浸提溶剂，提取次数条件下，最终确定鱼尾色素抗氧化成分的提取工艺为A2B2C2，即温度20℃、料液比1∶5，时间24h。对照正交表，正交实验9组实验中没有A2B2C2，按A2B2C2条件补加实验，重复三次取平均值，得色素提取物对DPPH自由基的清除率为58.44%，提取率达2.40%。

2.2 抗氧化活性的测定

2.2.1 DPPH自由基清除作用的测定 每个DPPH分子在溶液中可生成一个稳定的含氮自由基，具有典型紫色，在517nm处有强吸收，当它与提供1个电子的自由基清除剂作用时，生成无色产物，使溶液的典型紫色变浅。由图5可知，鱼尾中抗氧化成分对DPPH自由基具有一定的清除能力，且随质量浓度的增加而增强。在低浓度实验范围0.2～0.4mg/mL内，服从线性分布y=－8.965+151.55x，R2=0.998，其IC50值分别为0.3891mg/mL。

2.2.2 ABTS+自由基清除作用的测定 ABTS+经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+·，加入提取物后，若该提取物具有抗氧化活性，则会与ABTS+·发生反应而使反应体系褪色［14］。由图6可知，随着浓度的增加，各提取物对ABTS+自由基的清除率也随之增大，在实验浓度范围内服从线性分布y =28.256+11.444x，R2=0.996，其IC50值1.8654mg/mL。

2.2.3 还原力的测定 许多研究表明［15－16］，抗氧化活性与还原力之间普遍存在相关性，可通过测定还原力来表示抗氧化活性的强弱，吸光度越高，还原能力越强。由图7可知，鱼尾色素提取物具有一定的还原能力，与自由基清除率相似，随提取物质量浓度的增加而增强。在实验浓度范围内，服从线性分布y= 0.070+0.457x，R2=0.986。

图5 提取物浓度对DPPH自由基清除率的影响Fig.5 Effect of extract concentration on rate of scavenging DPPH free radical

图6 提取物浓度对ABTS+自由基清除率的影响Fig.6 Effect of extract concentration on rate of scavenging ABTS+free radical

图7 提取物浓度对还原力的影响Fig.7 Effect of extract concentration on the reduction power

3 结论

通过单因素实验，确定了各因素对鱼尾色素中抗氧化成分的影响规律，选取因素水平值的理想范围进行正交实验及显著性分析，确定了较佳的提取工艺为:浸提溶剂无水乙醇、温度20℃、料液比(g/mL)1∶5、时间24h、浸提1次，此条件下色素提取物的提取率达2.40%，对 DPPH自由基清除率为58.44%。抗氧化活性实验表明，鱼尾色素提取物具有较强的清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力，且随提取物质量浓度增加而增强，其IC50值分别为0.3891mg/mL和1.8654mg/mL。还原力测定实验也得出相似的结果。

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Study on the extraction of antioxidant components from Tilapia fishtail pigment and evaluation of their activities

DUAN Zhou－wei，SHEN Xuan－ri*，LI Peng，CHEN Xiu－ming，QIN Liu－xiang
(Collage of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China)

The antioxidant activity compounds of fishtail pigment used ethanol as extraction solvent，was studied by means of extraction rate and DPPH free radical scavenging.Antioxidant activities of extract were evaluated by three different methods，such as DPPH and ABTS radical scavenging assay，potassium ferricyanide reduction method. The results showed that the better antioxidant components extraction conditions were extracted 1 time at 20℃ for 24h with solid－liquid ratio(g/mL)1∶5 by solvent ethanol.Under this condition，the antioxidant components extraction rate reached to 2.40%of the fish tail wet weight，and the clearance of DPPH free radicals was 58.44%.What’s more，the experiment of antioxidant activity showed that the extracted fishtail pigment presented the strong antioxidant activity to the DPPH and ABTS+radical，and their IC50were 0.3891mg/mL and 1.8654mg/mL，respectively.

fishtail;antioxidant;extraction;1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl(DPPH)

TS254.1

A

1002－0306(2012)10－0143－05

罗非鱼(Oreochromis niloticus)又称非洲鲫鱼，属鲈形目、鲡鱼科。近年，我国罗非鱼养殖产业发展迅速，2009年罗非鱼产量已达125.7万t［1］，2010海南罗非鱼总产量为26.7万t［2］，其中罗非鱼及其鱼片的出口量占全国的40%，居全国第1位［3］。罗非鱼在加工过程中产生大量的下脚料，包括鱼头、鱼骨、鱼鳞、鱼尾和内脏等，约占原料鱼的40%～55%［4］，除小部分被用于生产饲料外，大部分被丢弃，造成了环境污染和资源的浪费。近年来，国内很多研究部门围绕罗非鱼加工副产物的综合利用进行了大量的研究，如罗非鱼皮鱼鳞胶原蛋白的提取［5］，罗非鱼头的利用［6］，罗非鱼内脏及鱼骨的研究［7］等。可是，国内外对罗非鱼尾的利用研究较少，特别是对鱼尾色素中抗氧化活性成分的研究少见报道。本实验以罗非鱼尾为研究对象，探讨了罗非鱼尾色素中抗氧化成分的提取方法及其抗氧化活性，旨在为鱼尾色素的抗氧化利用提供理论基础，进一步提高罗非鱼加工副产物的利用价值。

2011－09－26 *通讯联系人

段宙位(1985－)，男，硕士研究生，研究方向:水产品加工。

科技部科技人员服务企业行动项目(2009GJE20022);海南省自然基金项目(309007)。