复合精油对黄曲霉联合抑菌作用研究

曲春阳，潘磊庆，屠 康，杨立之

(南京农业大学食品科技学院，农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，江苏南京210095)

复合精油对黄曲霉联合抑菌作用研究

曲春阳，潘磊庆，屠 康*，杨立之

(南京农业大学食品科技学院，农业部农畜产品加工与质量控制重点开放实验室，江苏南京210095)

采用联合抑菌评价方法，通过测定植物精油抑菌圈直径、最低抑菌浓度(Minimum Inhibition Concentration，MIC)、最低生长下降浓度(Reduction Concentration，RC)、联合抑菌指数(Fractional Inhibitory Concentration，FIC)，对植物精油单独及联合使用后的抑菌效果进行评价，筛选最佳抑制黄曲霉活性作用的复合精油种类及配比。结果表明:大蒜、肉桂、丁香、薄荷精油单独或复合使用均有较强抑制黄曲霉活性的作用。大蒜与肉桂精油联合抑菌评价为相加作用。当大蒜精油与肉桂精油复合体积比为1∶3时，复合精油具有最佳抑制黄曲霉活性的效果。因此，复合精油作为有效防霉保鲜成分具有良好的研发与应用前景。

复合精油，黄曲霉，联合抑菌，效果

1 材料与方法

1.1 材料与设备

表1 十二种植物精油对黄曲霉的固相抑菌圈直径Table 1 The antibacterial circle diameter of twelve kinds of essential oil

植物精油(大蒜、丁香、肉桂、薄荷等)100%纯度，郑州雪麦龙香精香料有限公司;黄曲霉(Aspergillus flavus) 中国工业微生物菌种保藏中心;大米 水分含量为15.5%，江苏农垦米业集团三河米厂;其它试剂 均为分析纯，南京试剂厂;查氏 自制。

BD－HWS－150型恒温恒湿培养箱 南京贝帝实验仪器有限公司;SW－CJ型超净工作台 上海新苗医疗器械制造有限公司;CX21型生物显微镜OLYMPUS(日本);立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;HH－6型数码恒温水浴锅国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液制备 用接种环挑取3～4环培养5d左右的黄曲霉菌孢子置于10mL带无菌玻璃珠的无菌水中，采用活菌计数法测定菌数，制成菌体浓度为106～107CFU/mL的均匀菌悬液。

1.2.2 抑菌圈实验 平板扩散法(气相)［9］:取菌悬液0.1mL滴入查氏培养基，涂布均匀即成含菌平板。在无菌条件下，于无菌平皿中倒入20mL培养基，待培养基凝固后，用平板涂布法将黄曲霉涂于平皿培养基上，然后将灭菌滤纸片(d=6mm)贴于含菌平板的皿盖中央，取精油试样20μL滴到贴好的无菌滤纸片上，培养皿用保鲜膜密封。将培养皿置于28℃培养5d，测量抑菌圈大小。用无菌水做对照，重复实验3次。

滤纸片法(固相)［10］:取菌悬液0.1mL滴入培养基中，涂布均匀即成含菌平板。取精油试样20μL滴到无菌6mm直径的圆滤纸片上，在无菌条件下将滤纸片贴在含菌平板琼脂表面中央，将接种好的培养皿用保鲜膜密封，于28℃倒置培养5d，测量抑菌圈大小。用无菌水代替精油做对照，重复实验3次。

抑菌圈实验判定标准:抑菌圈直径＞15mm为最敏感，10～15mm为中度敏感，7～9mm为低度敏感［11］。

1.2.3 最低抑菌浓度(MIC)实验［9］将菌悬液0.1mL滴入已灭菌冷却凝固的培养基，涂布均匀即成含菌平板。精油用0.22μm的微孔过滤器过滤，并用Tween－80稀释。吸取各稀释液1mL于无菌条件下加入到含菌平板的皿盖中央，倒置培养，使培养皿内空气中精油浓度分别达到1～180mg/L空气系列浓度，于28℃培养5d，以不生长菌的样品的最低浓度为精油的MIC。

气相抑菌实验中精油的浓度表示为:培养皿内单位体积空气中含有的精油体积，即mg/L(空气)。

1.2.4 最低生长下降浓度(RC) 使微生物出现明显生长下降的最低浓度。

1.2.5 植物精油联合抑菌效果评价 以分级抑菌浓度指数(FIC)作为联合抗菌实验效果的判定依据。

FIC指数的计算［9］:

FIC指数判定标准为:

FIC指数≤0.5时为协同作用;0.5＜FIC指数≤1为相加作用;1＜FIC指数≤2为无关;FIC指数＞2时为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 十二种植物精油对黄曲霉固相抑菌圈的测定

参照抑菌圈实验判定标准，表1的结果显示，大蒜精油与薄荷精油在实验期内能够完全抑制黄曲霉的生长，其供试平板几乎完全不长菌，属于最敏感范畴;肉桂精油、丁香精油和香茅精油也对黄曲霉有较强的抑制作用，但抑制效果依次降低，但也属于最敏感范畴;花椒精油对黄曲霉也有一定的抑制作用，属于中度敏感范畴;香柏木精油、八角茴香精油、桉树(尤加利)精油对黄曲霉抑制作用较弱;孜然精油、生姜精油和迷迭香精油对黄曲霉没有抑制作用。大蒜精油和薄荷精油抑菌范围广但程度浅，肉桂和丁香精油抑菌圈轮廓分明，且抑菌程度较深。刘晓莉等［12］用丁香精油和肉桂精油对黄曲霉等霉菌进行气相与固相抑菌圈的测定，其中丁香精油的抑菌圈直径为28.3mm，肉桂精油抑菌圈直径为38.5mm，与本实验结果相似，属于同一敏感范畴。综上所述，大蒜精油、薄荷精油、肉桂精油和丁香精油具有较好抑制黄曲霉活性的效果。

2.2 单一及复合精油对黄曲霉抑菌的效果

根据大蒜与薄荷精油和肉桂与丁香精油对黄曲霉不同的抑菌特点，进一步探究其单一与复配精油对抑制黄曲霉活性效果的变化。将该四种精油进行等体积浓度互配与单一精油对黄曲霉气相与固相抑菌圈直径进行测定，结果如表2所示。

表2 单一及复合精油对黄曲霉的抑菌圈直径Table 2 The antibacterial circle diameter of single and combined essential oil

由表2可知，大蒜精油单用和大蒜与肉桂精油等体积混用，它们的气相和固相抑菌圈直径均为最大(＞90mm)，属于最敏感范畴，其次是薄荷精油单用、大蒜与薄荷精油和大蒜与丁香精油等体积混用，均有较大的气相和固相抑菌圈直径;其他单一与混合精油对黄曲霉也均有较好的作用效果，除了丁香精油气相抑菌圈为中度敏感，其他均为最敏感范畴。不仅再次验证该四种植物精油对黄曲霉有较强的抑制作用，并且其混合使用效果又优于单一使用效果的趋势;大蒜精油与肉桂精油等体积混用的效果与大蒜精油单一使用的效果一致，均有最强抑制黄曲霉活性的效果。

2.3 大蒜、肉桂及其复合精油对黄曲霉抑制的效果

为了科学评价大蒜精油与肉桂精油及其复合精油对黄曲霉活性抑制情况，对它们进行气相最低抑菌浓度(MIC)，最低生长下降浓度(RC)和联合抑菌评价(FIC)实验，结果如表3所示。

表3 大蒜、肉桂精油及复合精油对黄曲霉气相的MIC、RC和FICTable 3 The MIC、RC and FIC of garlic，cinnamon，and combined essential oil

由表3可知，大蒜与肉桂等体积复合精油的MIC、RC最小，分别为25.6mg/L和19.3mg/L，说明该复合精油比单一精油使用有较好的抑菌效果。大蒜精油比肉桂精油的MIC和RC小，说明大蒜精油比肉桂精油抑制黄曲霉效果好。并且从其实验效果可知，大蒜精油具有明显的抑菌乃至杀菌的效果，但其有效作用时间较短，由闫淼淼［13］研究可知，大蒜独特的辛辣气味来源于一类性质稳定、无色无味的风味前体物质类物质S－烃基－半胱氨酸亚砜(cysteine sulphoxides，CSOs)，再经过一系列的氧化还原反应形成挥发性的含硫化合物。当大蒜受到物理破碎后，细胞膜破裂，细胞质中的CSOs(主要是蒜氨酸)被液泡中的蒜氨酸酶催化分解成2－烯丙基次磺酸和氨基丙酮酸，而2－烯丙基次磺酸很不稳定，易发生聚合反应生成具有强烈辛辣味的挥发性物质——硫代亚磺酸酯类(主要是大蒜素)。大蒜素又会迅速降解为挥发性的含硫化合物DAS，DADS，DATS，Ajoene，Vinyl dithiins等。由于大蒜素易挥发扩散至空气中，因此大蒜精油会产生作用范围广时间短的抑菌特点。

肉桂精油主要抑菌成分为肉桂醛(cinnamaldehyde)，国内外已有多项研究成果报道［14－15］肉桂醛具有较强的抑制霉菌的作用，它不仅能抑制霉菌孢子萌发，还能抑制菌丝体生长和孢子的产生。由于肉桂醛是醛类物质，其在精油中存在状态为液态，挥发性比大蒜素要低，因此会显示比较稳定持久的抑菌特点。此外，选择气态抑菌实验的原因是抑菌物质的抑菌性主要是基于霉菌孢子对抑菌物质的吸收而起作用，气态抑菌状态更有利于孢子对抑菌物质的吸收，因此主要抑菌物质为气态的植物精油对霉菌的抑制效果更好［16］。

抑菌剂的联合抑菌效果可以通过FIC指数的计算，判定各抑菌物质间是否有协同、相加、无关和拮抗作用。相加作用是指混合抑菌剂的抑菌效果等于各抑菌剂单独使用的效果之和;协同作用是指混合抑菌剂的抑菌效果优于各抑菌剂单独使用的效果之和;拮抗作用是指混合抑菌剂的抑菌效果低于其中某一种或几种抑菌物质剂单独使用的效果［17］。由表3的FIC指数计算结果可以得出，大蒜精油单独使用的FIC值为0.52，肉桂精油单独使用的 FIC值为0.47，复合精油的FIC值为0.99＜1，说明大蒜和肉桂复合精油对黄曲霉的抑菌效果表现为相加作用，该实验结果表明大蒜与肉桂精油(1∶1)复合使用比单独使用的抑菌效果好。

2.4 不同浓度复合精油对黄曲霉抑菌活性的测定

由以上实验效果可知，肉桂精油和大蒜精油的复合精油抑菌效果比单独使用好，但不同的配比浓度的复合精油有不同的抑菌效果，因此，为进一步确定最佳复合精油配比浓度，进行体积比为大蒜精油∶肉桂精油=1∶7、1∶5、1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1的复合精油对黄曲霉气相与固相抑菌圈的测定，结果如表4所示。

表4 不同配比浓度复合精油对黄曲霉的抑菌圈直径Table 4 The antibacterial circle diameter of combined essential oil with different volume ratio

由表4可知，大蒜精油与肉桂精油体积比为1∶3的复合精油具有最大的气相和固相抑菌圈直径，说明该浓度的复合精油具有最强的抑制黄曲霉活性效果。此外，由表4中还可看出，复合精油中大蒜精油浓度大于肉桂精油浓度时，气相抑菌圈几乎消失，固相抑菌圈直径随着大蒜精油浓度的增加而逐渐减小;当复合精油中的肉桂精油浓度大于大蒜精油浓度时，均有较明显的抑菌圈出现，并且随着肉桂精油浓度增加，气相抑菌圈直径减小，固相抑菌圈直径也有减小的趋势。因此可推测，肉桂精油有效作用成分(肉桂醛)在复合精油对黄曲霉抑菌过程中起主要作用。综上所述，大蒜精油与肉桂精油体积比为1∶3的复合精油具有较好地抑制黄曲霉活性效果及防霉保鲜应用前景。

3 结论

实验研究从12种植物精油中通过气相、固相抑菌圈直径和最低抑菌浓度(MIC)的测定方法筛选得出大蒜精油和肉桂精油具有较强的抑制黄曲霉活性的作用。参照抗菌素联合作用常用的FIC指数联合抑菌评价方法，证实大蒜与肉桂精油复合抑菌性具有相加作用，且对其最佳配比浓度进行筛选实验，得出大蒜精油与肉桂精油体积比为1∶3的复合精油具有最佳抑制黄曲霉活性得效果。

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Research of the inhibition activities effect of complex essential oil on Aspergillus flavus

QU Chun－yang，PAN Lei－qing，TU Kang*，YANG Li－zhi
(College of Food Science and Technology，Key Lab of Agri－food quality and processing，MOA，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

The Diameter of Antibiotic Circle，Minimum Inhibition Concentration(MIC)，Reduction Concentration(RC) and Fractional Inhibitory Concentration(FIC)of plant essential oils which used in single or combined were tested，and the fungicidal activities were evaluated by combined antiseptic evaluation method in order to find the best types and ratio of essential oils for inhibiting activities on Aspergillus flavus.The results indicated that garlic，cinnamon，clove and mint essential oils had strong inhibition activities on Aspergillus flavus.Combination of garlic and cinnamon essential oil showed surperimposed inhibition effects on Aspergillus flavus.The combined essential oil of garlic and cinnamon essential oil had the best inhibition effect on Aspergillus flavus when the volume ratio of them was 1∶3.Therefore，this type of combined essential oil had a potential for the further applications as effective fungicidal components.

complex essential oil;Aspergillus flavus;combined inhibition;effect

TS225.1+9

A

1002－0306(2012)10－0128－04

植物精油(essential oil)或香精油(ethereal oil)，是一类植物源次生代谢物质，分子量较小、可随水蒸气蒸出、具有一定气味的挥发性油状液体物质［1］。植物精油具有抑菌、杀虫、抗氧化等活性，在医药、农药、饲料添加剂、食品防腐保鲜等方面有广泛应用［2－3］。植物精油具有来源于天然、对人体相对安全、与环境友好、生物活性多样等特点，越来越引起人们的关注［4］。黄曲霉(Aspergillus flavus)，是真菌中一类半知菌(Fungi inperfecti)，能够分泌B1、B2、G1、G2等10余种毒素，其中B1是已知毒性最强的一类有机化合物，是该曲霉类中产毒菌株主要的次生代谢产物。黄曲霉最易着生于花生、玉米、大米等粮油或其制品上，其所含毒素状况是农产品进出口常规检测项目。黄曲霉毒素是一种毒性极强的剧毒物质，它的毒性比氰化钾大10倍，比砒霜大68倍［5］。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WTO)的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一［6］。世界上已有大约100个国家对食品中黄曲霉毒素的含量做了严格限量要求［7］。我国花生及其制品、食用油、油料饼粕及饲料和玉米、大米等农产品和食品的黄曲霉毒素污染比较严重，并已引发多起因黄曲霉毒素超标而导致的农产品国际贸易纠纷［8］。因此，采取有效的控制和预防措施，通过利用天然植物精油的抑菌防霉作用，防止农产品被黄曲霉及其毒素污染，特别是联合抑菌法筛选研究具有最佳抑制黄曲霉活性的单方或复合植物精油作为防霉保鲜剂的主要抑菌成分，对保证大米安全和减少经济损失，从而实现绿色储粮具有重要意义。

2011－09－05 *通讯联系人

曲春阳(1985－)，女，硕士研究生，主要从事食品储藏与保鲜方面的研究工作。

农业部948项目(2011－S10);中央高校基本科研业务费南京农业大学项目(KYZ201120);江苏省高校优势学科建设工程。