重组腺病毒载体负载树突状细胞诱导乙肝病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞

陶然 李进 张克 马世武 姜维 李溢柔 周向军

特异性细胞免疫反应是机体清除感染病毒和变异细胞的主要机制，体内特异性细胞免疫反应的启动需要抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC），主要包括树突状细胞（dendritic cells，DC）对抗原的递呈[1-2]。慢性乙肝患者体内针对乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）的特异性免疫应答低下，DC功能障碍（如捕获抗原能力下降或成熟受阻等）被认为是主要原因之一[3-5]。本研究探索了用携带有HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）基因的重组腺病毒 CHB3体外感染DC进行抗原负载的方法和效果，为慢性乙肝患者体内免疫反应低下提供解决方案。

材料和方法

一、实验材料

1.研究标本：健康志愿者，知情告知并签署知情同意书，肝素钠抗凝管抽取外周静脉血50 ml。

2.主要试剂：淋巴细胞分离液（美国Hyclone公司）；GM-CSF、IL-4、Cocktail、IL-2(美国PeproTech公司)；1640培养液，AIM-V培养液（美国Invitrogen公司）；PAA淋巴细胞培养液（德国PAA公司）；CD86- FITC、CD83- PE、CD80- PEcy5、HLA-DRFITC、CD14-APC、CCR7-PE、FITC羊抗鼠荧光二抗（美国BD公司）；HBcAg-pentamer-PE检测试剂（美国Proimmune公司）。

二、实验方法

1.外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分离及 DC 的体外培养：700 ×g离心 20 min 分离血浆，剩余血应用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）1:3稀释后，淋巴细胞分离液分离PBMC，细胞计数，用RPMI1640基培重悬细胞，调整细胞密度为 5 × 106个 /ml，接种于 24 孔板中，每孔接种1 ml，然后置于 37℃、5﹪CO2培养箱内静置培养，1.5 h后，在超净工作台内，吸除未贴壁细胞，并应用无菌杜氏磷酸缓冲液（dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS）液洗涤细胞 3 次，最后加入 rhGM-CSF( 800 U/ml）、rhIL-4( 400 U/ml）、青霉素 100 U/ml、链霉素 100 U/ml，并分别用 2﹪ 自体血浆（autologous plasma，AP）的 RPMI1640 完全培养基（或 AIM-V）0.5 ml，37℃、5﹪CO2培养箱内培养。10 h后，吸除上清，并用RPMI1640基培洗涤细胞3次，最后应用上述加入细胞因子、抗生素和含有 2﹪AP的RPMI1640完全培养基（或AIM-V）1 ml，37℃、5﹪CO2培养箱内培养。体外培养的第3、5天半量换液。

2.重组腺病毒载体感染DC：为研究重组腺病毒载体能否感染DC并介导外源抗原在DC中的表达，选取健康志愿者2例，分离PBMC诱导培养DC。选用携带HBV核心抗原的腺病毒载体CHB3以不同的滴度感染第6天DC，感染剂量分别为5 MOI、10 MOI、20 MOI、40 MOI。 感染24 h后，收集感染细胞裂解后取上清进行免疫分析仪检测（图1）。其中阳性对照组为20 μg/ml HBcAg 蛋白，阴性对照组为 Ad-GFP 40 MOI感染组。

为研究HFP3对重组腺病毒感染DC细胞效率的影响，选用携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的腺病毒载体Ad-GFP以不同的滴度感染DC，感染剂量分别为2.5 MOI、5 MOI、10 MOI、20 MOI，分为 2 组，一组不加HFP3；另一组加入HFP3 50 μmol/L。感染24 h后，用荧光显微镜观察GFP蛋白的表达，并用流式细胞仪分析GFP阳性细胞比例（图2）。

图1 选用携带HBV核心抗原的腺病毒载体 CHB3 以不同的滴度感染第6天DC，感染剂量分别为 5 MOI、10 MOI、20 MOI、40 MOI。感染24 h后，收集感染细胞裂解上清进行免疫分析仪检测。其中阳性对照组为20μg/ml HBcAg蛋白，阴性对照组为 Ad-GFP 40 MOI感染组。结果显示在空载病毒 Ad-GFP 感染的 DC 中未检测到HBcAg 蛋白的表达，但在 CHB3 感染的 DC 中检测到 HBcAg 的高效表达，其表达水平随感染剂量的增加而提高

图2 选用携带 GFP 的腺病毒载体 Ad-GFP以不同的滴度感染 DC，感染剂量分别为2.5 MOI、5 MOI、10 MOI、20 MOI，分为 2 组，一组不加 HFP3；另一组加入 HFP3 50 μmol/L。图a为感染 24 h后，用荧光显微镜观察 GFP 蛋白的表达（×100），图b为用流式细胞仪分析GFP 阳性细胞比例。结果显示加入 HFP3感染组，感染效率约提高 3～ 10 倍。

3.目的基因的表达检测：（1）荧光显微镜下观察Ad-GFP表达，Ad-GFP感染DC24 h后，倒置荧光显微镜（Nikon，ELIPSE Ti）拍照记录。（2）Elisa法检查培养上清中的乙肝核心抗原，CHB3腺病毒感染 DC 24 h后，收获 DC，用 PBS洗 3次，冻融法裂解细胞，离心取上清，用雅培免疫分析仪检测细胞裂解上清中核心抗原含量。（3）ICS法检测DC内乙肝核心抗原，CHB3腺病毒感染DC 24 h后，收获DC，用PBS洗2次，用流式胞内间接染色法染色，一抗为鼠抗人HBcAg单抗，二抗为羊抗鼠IgG-FITC。

4.DC表面标志检测：为了研究腺病毒载体感染对DC分化发育的影响，选取健康志愿者6例，分离PBMC诱导培养DC。用CHB3病毒感染iDC，培养 24 h 后收集细胞，取 1 × 106个细胞置于流式检测管中，1 ml PBS离心洗涤细胞2次，加入流式单克隆抗体CD83-PE、CD86-FITC和CD80-PEcy5（或 CCR7-PE、CD14-APC、HLADR-FITC）各10μl，并设同型对照，4℃避光孵育30 min；1 ml的 PBS 溶液离心洗涤 2 次，加入 2﹪多聚甲醛 100 μl重悬细胞并固定 20 min，流式细胞仪分析 CD14、CD80、CD83、CD86、CCR7和HLA-DR的表达（图3）。

图3  CHB3病毒载体CHB3感染DC流式检测结果

5.五聚体检测：（1）选取2例HLA-A2阳性、HBV表面抗体和核心抗体阳性的健康志愿者，用优化方案培养DC进行CHB3负载，感染的DC用Cocktail促成熟。（2）淋巴细胞用培养液以 2 × 106个 /ml  的浓度重悬。220 ×g离心8  min，收集正常培养的DC和感染后的DC，用培养液将其以 2 × 105DC/ml  的浓度重悬。将DC 1 ml/ 孔（2 × 105个 / 孔）加入 12 孔板中，再加入 1 ml/ 孔的淋巴细胞（2 × 106个 / 孔），即 DC和淋巴细胞的比例为1:10。将共培养的细胞放入CO2培养箱中，按要求的时间收集细胞进行五聚体检测。（3）收细胞，每管（1～ 2 ）× 106个细胞，每份样品共 2 管。用 PBS 2 ml洗涤 (600 ×g离心5 min)1次，在倒掉废液前检查是否有细胞沉淀块。收集洗涤的细胞至新的离心管中，分别加10 μl Pentamer或于1管中混合，在22℃避光孵育 10 min；用 PBS 2 ml 洗涤 1 次细胞，600 × g,离心 5 min，弃上清；2 管均加入 3～5 μl CD8-APC，4℃避光孵育 20 min；再用 PBS 2 ml 洗涤1次，弃上清；重悬于200μl 2﹪多聚甲醛，流式细胞仪检测。CD8-APC单染管为对应的同型对照。流式检测时收集细胞数为 (1～ 2)×105个，用美国BD公司的Cell Quest软件进行分析。HBV特异性 CTL 细胞的阳性率 (﹪) = penta+CD8+/ CD8+× 100﹪。

三、统计学分析方法

应用统计软件SPSS17.0进行统计分析，采用不同时间iDC的分子表达差异，以P< 0.05为差异有统计学意义。

结  果

一、细胞形态图

DC 体外培养 5～ 7 d 时，流式细胞仪检测发现细胞明显增大（图4），未成熟DC为半贴壁状态，细胞圆而透亮，表面有细小轴突，大部分为单个，少数聚集成簇。加入抗原刺激4 h后，细胞伸长贴壁，胞质向外延伸，聚集形成集落。不同培养基培养的DC形态不同。

二、重组腺病毒载体感染DC

在空载病毒Ad-GFP感染的DC中未检测到HBcAg蛋白的表达，但在CHB3感染的DC中检测到HBcAg的高效表达，其表达水平甚至比阳性对照组更高，并在一定范围内与病毒滴度呈正比。

三、HFP3对重组腺病毒感染DC效率的影响

表1   不同HFP3剂量梯度对重组腺病毒感染DC效率的影响(﹪)

加入HFP3辅助腺病毒感染DC，感染效率约提高3～ 10倍。为研究病毒剂量和HFP3的最佳用量，以不同 CHB3 梯度（40 MOI、60 MOI、80 MOI）及不同 HFP3 梯度（25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）组合分别感染 DC，感染24 h后，收集DC，用流式胞内间接染色法检测DC胞内HBcAg蛋白的表达（表1）。经双变量F检验分析，感染效率与CHB3-MOI差异有统计学意义（P= 0.0002），感染效率与 HFP3 浓度差异有统计学意义（P= 0.0004）。结果表明，感染效率在一定范围内与病毒滴度MOI和HFP3用量呈正比。综合最佳DC培养方案和最佳HFP3浓度，检测腺病毒CHB3对DC的感染效率和感染后DC活细胞比例均可达80﹪以上（图5）。

图4 光学显微镜下观察抗原刺激前后DC细胞形态 

四、腺病毒负载DC表面标志检测

CD14各组均为阴性显示各组DC均已从单核成功分化。腺病毒载体CHB3感染能活化iDC，使得iDC的CD80、CD86和CCR7分子的表达上调但差异无统计学意义 (P=0.209、0.430、0.054),CD83和HLA-DR的表达不受腺病毒载体影响。为了进一步阐述感染DC的功能状态，研究了这些细胞对Cocktail刺激的应答情况[6]。iDC感染后加Cocktail 促成熟24 h后进行检测，结果发现，Cocktail刺激能诱导感染DC的成熟，具体表现为CD80、CD83、CD86和CCR7分子的显著上调，结果有统计学意义 (P=0.0019、0.017、0.021、0.0016)。

图5 不同CHB3梯度下对DC的感染效率与活细胞比例

五、腺病毒CHB3载体负载的DC诱导HBcAg特异性CTL

以自体非贴壁PBMC细胞为对照，这类志愿者的PBMC内有HBcAg特异性CTL的本底水平分别为0.25﹪和0.19﹪，经过CHB3负载的DC体外刺激仅1周后，HBcAg特异性CTL的水平显著上调 7～ 8 倍，分别为 1.98﹪ 和 1.37﹪( 图6)。

图6 病毒CHB3负载DC诱导HBcAg特异性CTL流式细胞图

讨 论

我国是HBV感染的高发地区，目前HBsAg携带率达7.18﹪，超过1.1亿人，需要进行抗病毒治疗的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者约为2000万，其中25﹪～ 40﹪可发展为肝硬化和肝癌，每年约70万人死于乙肝相关并发症，包括肝硬化、肝癌，HBV感染严重威胁着人民的生命健康。目前尚无根治HBV感染的药物，现有的治疗药物存在复发率高，耐药或有效率较低的局限性。因此，临床上迫切需要探索新的治疗方法，以解决目前抗病毒治疗过程中存在的问题。

尽管CHB的发病机制目前尚不完全清楚，但现有的证据表明：影响HBV的致病并不完全依赖于病毒本身[7]，宿主对HBV的免疫反应可能在致病因素中起到了重要的作用[8]。急性HBV感染者，机体针对HBV会产生强烈的多特异性免疫反应，而慢性HBV感染者则出现弱的免疫反应[9]。Chisari等[10]通过HBV转基因鼠模型研究发现：HBV抗原诱导的细胞免疫应答对于清除细胞内的HBV发挥重要的作用，作为“双刃剑”，它也参与了HBV感染引起肝细胞炎症损伤的过程。在清除HBV的过程中，包括溶胞机制及非溶胞机制，而且非溶胞机制中IFN-γ，TNF等细胞因子起到主要作用，可以缩短乙肝病毒共价闭合环状DNA的半衰期，从而达到抑制HBV DNA复制的目的。而慢性乙肝患者体内CTL功能减弱是导致乙肝慢性化的关键性因素，CTL的功能恢复是免疫治疗CHB的重要目标。因此，除了应用抗病毒治疗外，增加针对HBV的自身免疫细胞数量，进行免疫重建是一条治疗CHB的新思路。

本研究以DC作为切入点，探索了用携带有HBcAg基因的重组腺病毒在体外感染DC，将HBcAg基因带入DC内表达，使内源性HBcAg经DC加工递呈，从而诱导HBV特异性CTL反应的可行性。

DC作为已分化的、有丝分裂后期的免疫细胞，难以转染外源基因，常规方法往往转染效率低下。腺病毒载体能够转染这类非分裂细胞，但需要很高的病毒剂量，转染达到100 MOI～ 1000 MOI以上。Naoki等[11]的研究结果显示腺病毒的离心感染法能在一定程度上提高DC的感染效率，但研究表明，较高的腺病毒感染剂量或长时间离心操作都会严重影响DC活性（结果未显示）。为了探索一种优化的腺病毒载体感染DC的方法，既能用较低的病毒剂量获得较高的感染效率，又不影响DC活性，引入了一种新的HFP3短肽辅助感染，结果表明HFP3能显著提高腺病毒载体负载DC的效率3～ 10倍，感染效率在一定范围内与HFP3用量呈正比。采用优化的HFP3感染方案，腺病毒CHB3对DC的感染效率可达到80﹪～ 90﹪以上；腺病毒载体CHB3的感染能活化未成熟DC，使得未成熟DC的CD80、CD86和CCR7分子的表达上调。

重组腺病毒负载的DC与PBMC共孵育后，应用五聚体检测发现：这2例志愿者均可以诱导出针对HBcAg18–27肽特异性的CTL，与PBMC相比明显升高。重组腺病毒的DC体外诱导T细胞生成针对HBcAg肽特异性的CTL，这是非常重要的。对于CHB患者，若应用DC疫苗直接注射方法可能会诱导体内PBMC生成针对HBV的CTL，或者采用体外进行免疫功能重建并回输给患者，可能会起到清除HBV的目的。目前仅得到的是初步结果，今后的工作还应扩大样本量，并体外检测HBV感染自然史的不同阶段，DC疫苗是否也会诱导出针对HBV的特异性CTL。

DC疫苗是目前最具开发潜力的疫苗之一，国外已有200多项DC疫苗临床研究方案在进行中。在2011年荷兰召开的国际细胞治疗年会（ISCT年会）上，DC被广泛认为是一种安全而有效的细胞免疫治疗方法。本研究系统地比较了腺病毒载体CHB3的抗原负载对DC表型功能的影响以及感染DC体外激活抗原特异性CTL的能力。这些结果更好地刻画了腺病毒载体介导的DC抗原负载条件，为DC细胞的临床应用提供了理论基础。

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