协同利用卵泡抑素、骨形成蛋白和Wnt11对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

李占全 赵勇 付晶京

心肌梗死是一种严重威胁人类健康的疾病，修补梗死的心肌是治疗心肌梗死的关键。实验表明，体内的多种干细胞具有分化成心肌细胞的能力[1]。注射分化的心肌细胞可以到达心肌梗死处，形成新的心肌并恢复心脏的功能[2]。找到一种能有效地诱导干细胞向心肌细胞分化的方法将有助于治疗心肌梗死。骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC)是一种多能干细胞，具有分化成心肌细胞的能力。研究表明卵泡抑素（follistatin, FS）、骨形成蛋白 (bone morphogenetic protein, BMP) 和 Wnt11均在心肌细胞的发育过程中表达并在心肌细胞形成的不同阶段起重要作用[3-5]。本研究探讨了协同利用FS、BMP6和Wnt11对人骨髓 MSC向心肌细胞分化的影响并首次证明协同利用三者可使人MSC出现类似于心肌细胞的形态学及基因表达的变化。

材料和方法

一、材料和试剂

DMEM培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，卵泡抑素、骨形成蛋白和Wnt11（美国R&D Systems公司），Ficoll分离液、D–hank液、青霉素和链霉素均为美国Sigma公司产品。

二、方法

1. MSC 的分离：(1) 用含肝素的 D-hank 液与抽取的健康人骨髓血 1:1 等量混匀，1000 ×g离心10 min，弃上清；(2)沉淀与含肝素的D-hank 液混匀，缓缓加入 Ficoll上层，1730 ×g离心30 min；(3)弃上清，抽取MSC至离心管中，PBS离心，冲洗2次；(4)沉淀加入DMEM完全培养液 (10﹪ 胎牛血清），按 2 × 105个 /cm2密度接种于培养瓶，37℃、5﹪ CO2培养箱全湿条件下培养。

2. MSC的传代培养：原代细胞生长到80﹪融合时，吸出培养液，PBS洗涤2次，取37℃预热过的 0.25﹪ 胰酶 2 ml，37℃消化 2 min。DMEM培养基终止消化，吹打细胞，使细胞完全从培养瓶中脱落并吹打成单细胞悬液。吸取细胞悬液至 15 ml的离心管中，1500 ×g离心 5 min，移去上清。PBS洗涤2次，加入DMEM培养液。1:2比例传代培养。2代细胞用于诱导实验。

3. MSC的鉴定：用流式细胞仪检测CD34 APC、CD45 FITC、CD90 PE 和 CD105PE 的表达。

4. MSC 的诱导：2 代 MSC 细胞，按 1 × 104个/cm2接种于含DMEM完全培养液的6孔板中。2 d后，换用含10﹪FBS的低糖DMEM培养液并分别在第1天，第8天和第16天，加入FS、BMP和Wnt11。

5.细胞RNA的提取及RT-PCR检测：Trizol试剂1 ml加入到6孔板中，提取总RNA。应用Invitrogen的RT-PCR检测试剂盒进行RT-PCR的检测。PCR 产物；(1) Nkx2.5，扩增长度 525 bp，正引物为 5'-AGCCCTGGCTACAGCTGCA- 3'，反引物为 5'- TGGGAGCCCCTTCTCCCCA-3'；(2) MEF2c，扩增长度 233 bp，正引物为 5'- GA CTTTCTGAAGGATGGGCAA-3'，反引物为5'- CAAGTGCTAAGCTTATCTCAGCA -3'；(3) GAPDH，扩增长度 139 bp，正引物为 5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′，反引物为 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAGC-3′。

结  果

一、FS、BMP6和Wnt11对人骨髓MSC形态变化的影响

人骨髓MSC在原代培养基中正常生长，20 d左右，细胞达到90﹪融合。传代后的 MSC多数为成纤维样的梭形细胞(图1a)。流式细胞仪检测表明细胞 CD90 和 CD105 阳性而 CD34 和 CD45 阴性。FS、BMP6和Wnt11处理后，细胞形态出现了明显的变化(图1b～ h)。特别是 BMP6处理后的第4天，细胞形态变粗(图1e)。Wnt11处理后，出现了许多柱形细胞(图1h)，相互交织，这与 Makino等[1]利用5-Aza诱导的心肌细胞非常相似。未处理细胞一直是梭形。

图1 FS、BMP6和Wnt11处理前后人骨髓 MSC 的形态变化

二、FS、BMP6和Wnt11对人骨髓MSC表达心肌细胞标志物的影响

RT-PCR检测显示FS、BMP6和Wnt11处理后的人骨髓 MSC表达心肌细胞的特异性标志物 NKx2.5和MEF2c。未处理细胞没有表达上述心肌细胞的特异性标志物(图2)。

图2 FS、BMP6和Wnt11诱导人骨髓MSC表达心肌性细胞特异性基因电泳图

讨 论

Makino等[1]1999年首次报道了利用5-Aza可以诱导骨髓MSC分化成心肌细胞。一般认为5-Aza是通过影响BMP信号系统的活性诱导MSC向心肌细胞分化[6]。由于5-Aza的毒性作用及诱导的心肌细胞可产生免疫排斥和肿瘤的后果，故5-Aza所诱导的心肌细胞无临床应用价值。

BMPs是心脏发育及心肌细胞形成中必不可少的调节因子[7]。BMP通过调节心脏重要的转录因子NKx2.5和MEF2c等的表达参与心脏发育及心肌细胞形成。Zhao等[3,8]报道FS通过调节BMP的作用影响心肌细胞形成，过量或缺乏FS均引起心脏发育异常。Genovese等[9]报道电刺激MSC分化成心肌细胞的同时，FS的表达也增加。电刺激使FS表达增加再诱导MSC向心肌细胞分化还是心肌细胞分化的同时伴有FS的增加尚不清楚。Wnt11在正常心脏发育及心肌细胞的形成过程中起重要作用[10-11]。剔除Wnt11的非洲爪蟾无心脏的形成。由于FS、BMP6和Wnt11在动物心脏及心肌细胞形成过程中的重要作用，本文探讨了协同利用FS、BMP6和Wnt11对MSC向心肌细胞分化的影响。

结果表明协同利用三者使MSC出现类似于心肌样细胞的形态学变化即出现了许多柱形细胞(图1h)及心肌细胞特异性标志物的表达(图2)。特别是BMP加入后MSC的形态变粗(图1e)，表明BMP对MSC的分化有重要影响。Wnt11加入后MSC出现了许多柱形细胞(图f、g、h)，相互交织，这与 Makino等[1]利用 5-Aza诱导的心肌细胞非常相似。表明Wnt11促进了MSC向心肌细胞的分化。同时，RT-PCR检测显示三者处理后的人骨髓MSC表达心肌细胞的特异性标志物NKx2.5 和 MEF2c。二者是心脏重要的转录因子及心肌细胞特定的标志物。这些标志物的表达表明所诱导的细胞不仅在形态上发生了朝向心肌样细胞的变化而且在基因表达层面也开始向心肌细胞方向分化。

Nurse等[12]认为细胞的形态是细胞的特定标志物之一。经过FS、BMP6和Wnt11处理后，MSC出现了类似于心肌样细胞的形态变化及心肌细胞特异性标志物NKx2.5 和 MEF2c的表达，说明三者可以诱导MSC朝向心肌样细胞分化。诱导的成熟心肌细胞除了应有形态学变化及心肌细胞特异性标志物表达外，细胞还应该能跳动、类似于心肌细胞的动作电位、有心肌样的超微结构及肌钙蛋白和心结蛋白的表达。目前，作者正进一步探讨诱导能跳动的心肌细胞，以便为找到一种能有效地诱导干细胞向心肌细胞分化的方法做出贡献。

1  Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro[J]. J Clin Invest, 1999, 103(5): 697-705.

2  Beitnes JO, Lunde K, Brinchmann JE, et al. Stem cells for cardiac repair in acute myocardial infarction[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2011, 9(8):1015-1025.

3 赵勇,周影,秦书俭,等.卵泡抑素参与了爪蟾心脏的形成 [J].解剖学杂志，2010，33(3):307-309.

4  van Wijk B, Moorman AF, van den Hoff MJ, et al. Role of bone morphogenetic proteins in cardiac differentiation[J]. Cardiovasc Res, 2007, 74(2): 244-255.

5  He Z, Li H, Zuo S, et al. Transduction of Wnt11 promotes mesenchymal stem cells transdifferentiation into cardiac phenotypes[J]. Stem Cells Dev, 2011, 20(10):1771-1778.

6  Choi SC, Yoon J, Shim WJ, et al. 5-azacytidine induces cardiac differentiation of P19 embryonic stem cells[J]. Exp and mol med, 2004, 36(6): 515-523.

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8 Yuasa S, Itabashi Y, Koshimizu U, et al. Transient inhibition of BMP signaling by Noggin induces cardiomyocytes differentiation of mouse embryonic stem cells[J]. Nat Biotechnol, 2005, 23(5):607-611.

9 Genovese JA, Spadaccio C, Rivello HG,et al. Electrostimulated bone marrow human mesenchymal stem cells produce follistatin[J]. Cytotherapy, 2009, 11(4): 448-456.

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