高效液相色谱法测定食品中亮蓝同分异构体

刘立萍，黄 蔚，唐序文，彭高英，刘 国，陈琳巧

(1.怀化市质量技术监督局产商品质量监督检验所，湖南 怀化 418000；

2.怀化市中方县质量技术监督局质量检验及计量检定所，湖南 中方 418005)

高效液相色谱法测定食品中亮蓝同分异构体

刘立萍1，黄 蔚2，唐序文1，彭高英1，刘 国1，陈琳巧1

(1.怀化市质量技术监督局产商品质量监督检验所，湖南 怀化 418000；

2.怀化市中方县质量技术监督局质量检验及计量检定所，湖南 中方 418005)

建立高效液相色谱法检测食品中亮蓝的新方法，初步证实食品中亮蓝主要为3种异构体的混合物。用聚酰胺层析柱净化，高效液相色谱法分离。色谱柱为Inertsil ODS-SP C18 (150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液，检测波长629nm。加标回收率为91.1%～94.7%。

亮蓝同分异构体；高效液相色谱；食品

食品色素是食品添加剂的重要组成部分，是食品工业不可缺少的原料之一。食品色素是以调节食品色泽为目的的重要食品添加剂，又称食用染料或着色剂，分为天然色素和合成色素两大类，其中，合成色素因色泽鲜艳、着色力强、稳定性好、价格低廉等特点而被广泛使用。最常用的有柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝5种，通常被混合使用；检测方法上，目前大多数是5种色素同时检测[1-12]。

亮蓝(brilliant blue，分子结构式见图1)为非偶氮类酸性染料，主要有3个同分异构体，主要为3个同分异构体的混合物(间位磺化物:对位磺化物:邻位磺化物＝75～85: 15～20:0～8)[13]。我国对允许使用的合成色素使用范围和使用量进行了严格规定[14]，也规定了标准测定方法[15]，推荐了高效液相色谱法、薄层色谱法和示波极谱法，其中高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)的准确度和灵敏度较高，所需仪器比较普及。

图1 亮蓝分子结构式Fig.1 Molecular structural formula of Brilliant Blue

亮蓝同分异构体难以分离[13]，食品中亮蓝检测的研究报导很少涉及同分异构体的情况，研究普遍认为亮蓝标样和食品中亮蓝为单一峰的纯品，以单一峰面积定量，食品中亮蓝为同分异构体的混合物还未见报道。在多种色素同时测定时，如不对亮蓝及其异构体加以分离辨认，会对其他色素的测定存在干扰。本研究用层析柱净化、反相高效液相色谱法分离，测定食品中亮蓝，实现了3种同分异构体的分离，以异构体组合峰面积准确定量。方法简单可靠，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

紫葡萄果味饮料、米花糖、绿豆饼、青苹果饮料、糖果、果冻由湖南省怀化市产商品质量监督检验所提供；聚酰胺粉(粒径0.075～0.15mm) 浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂； 0.45μm无机滤膜；玻璃层析柱(2cm×30cm，配有烧结玻璃垫和聚四氟乙烯旋塞)。

亮蓝标准物质[GBW(E)，编号100005a，批号08002：0.5mg/mL]仪表 国家标准物质研究中心；水为超纯水；溶液为水溶液；甲醇为色谱纯；所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂。

0.02mol/L乙酸铵溶液、甲醇-甲酸(6:4，V/V)混合溶液、乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1，V/V)、50g/100mL柠檬酸溶液、220g/L乙酸锌溶液、106g/L亚铁氰化钾、5g/100mL氢氧化钠溶液、体积分数10%乙酸溶液。

1.1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪(配二级管阵列检测器) 日本岛津公司；TC16-Ⅱ高速离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；真空泵。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-SP C18(150mm×4.6mm，5μm)日本岛津公司；柱温：25℃；流动相：甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(45:55，V/V)；流速：1.0mL/min；进样量10μL；检测波长629nm。

1.2.2 标准曲线制作

将亮蓝标准物质用超纯水配成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的标准使用液，在设定的色谱条件下，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。

1.2.3 聚酰胺树脂预处理

取聚酰胺，用90%～95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3～4倍体积的90%～95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。再依次用2～3倍体积5g/100mL氢氧化钠、3～4倍体积的蒸馏水、2～3倍体积的10%乙酸洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH值中性，105℃条件干燥，备用。

1.2.4 聚酰胺粉层析柱装配

将洗净的层析柱固定，关闭活塞。称取经预处理的聚酰胺粉2～3g(称准至0.01g)于100mL的小烧杯，加适量的水，用玻璃棒搅拌片刻，然后边搅拌边装入层析柱中，用水洗下柱内壁的树脂，最后用洗耳球轻敲层析柱，使树脂层高度为3cm左右，并且较为紧密，打开旋塞，使水流出到树脂顶部约0.5～1cm，关闭旋塞。层析柱出口与抽滤瓶(1000mL，配一单孔橡胶塞，孔中插一玻璃导管)的导管、抽滤瓶与真空泵之间均用硅胶管连接，形成完整的抽滤系统。

1.2.5 色素提取

液态样品：准确称取10～20g(精确到0.0001g)均匀的试样于50mL比色管(如为碳酸饮料和酒精饮料，则把盛有试样的比色管置于沸水浴中去除二氧化碳和酒精)，用50g/100mL柠檬酸溶液调节pH4～5，水定容至刻度，摇匀，备用。

糖果和果冻：准确称取5g(精确到0.0001g)粉碎并且均匀的试样于50mL比色管，加40mL水，置70℃水浴溶解，冷却后定容至刻度，摇匀，离心(6000r/min以上)，用滤纸干过滤，准确取20mL滤液于100mL小烧杯，用50g/100mL柠檬酸溶液调节pH4～5。

其他固体样品：准确称取5g(精确到0.0001g)粉碎并且均匀的试样于50mL比色管(如油脂含量高，用石油醚预先除去)，加入40mL乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1)，混匀并超声20min，室温静置10min，定容至刻度，摇匀，离心(6000r/min以上)，用滤纸干过滤，准确取20mL滤液于100mL小烧杯，用50g/100mL柠檬酸溶液调节pH4～5。

1.2.6 色素净化

准确取20mL样品提取液，移入层析柱，用水洗层析柱内壁；打开旋塞，启动真空泵，使色素吸附到树脂上，形成一个色素环带，用甲酸或柠檬酸调水pH值为pH4～5，洗涤3～5次，除去水溶性杂质，关闭真空泵，弃去洗涤废液；在抽滤瓶中放一支25mL的比色管，用来接收解吸液；连接并启动真空泵，用乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1)解吸树脂上的色素，解吸3次，每次5～6mL；关闭真空泵，倒出解吸液于50mL蒸发瓶，挥发至干，加水2mL，把残渣充分溶解，用无机滤膜过滤，滤液供分析用。

2 结果与分析

2.1 样品处理条件的选择

样品基质复杂，在试液中分别加2mL沉淀剂乙酸锌(220g/L)和亚铁氰化钾(106g/L)，虽然试样液变澄清，但絮状沉淀物对色素有吸附作用，经对比试验发现测定结果偏低，所以选泽不加沉淀剂。

用聚酰胺层析柱处理试样的方法比GB/T 5009.35— 2003《食品中合成着色剂的测定》优越。用聚酰胺层析柱吸附色素，得到色素环带，现象直观；把聚酰胺树脂加到基质复杂的试样中，吸附色素，用G3漏斗抽滤，容易产生堵塞现象；试样在层析柱中用甲醇-甲酸混合溶液(6:4，V/V)净化，发现亮蓝有流失现象，所以不用甲醇-甲酸混合溶液(6:4，V/V)净化试样，仅用pH4～5的水洗3～5次，除去水溶性杂质，然后用乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1，V/V)解吸树脂上的亮蓝，解吸时，环形色带向下迅速移动，直到色素完全被洗脱和收集，现象明显，操作方便。

2.2 流动相的选择

以0.05mg/mL的亮蓝标准品为研究对象，比较乙腈-0.02mol/L乙酸铵溶液和甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液两个流动相组合，发现甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液组合对亮蓝分离效果好。固定柱箱温度25℃、流速1.0mL/min和最大吸收波长629nm三个条件，改变流动相比例对亮蓝标准物质进行分离。当流动相甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液体积比为45:55时，在30min内，只有紧邻的3个峰，见图2，峰形好，峰纯度指数均为1.0，3个峰对应的光谱图完全相同，见图3。因为亮蓝3个异构体的结构非常相似，因此，初步认为3个峰相应的组分是亮蓝的3个同分异构体。依据文献[13]，峰面积最大的峰3应该是间位磺化物，峰2是对位磺化物，峰1是邻位磺化物。根据所得峰面积计算，峰3:峰2:峰1＝76:21:3，与文献[5]报道的含量范围相符。当甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(50:50，V/V)时，3个峰之间有一定的重叠；当甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(40:60，V/V)时，虽然3个峰之间分离好，但出峰时间推迟，峰形展宽。所以甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(45:55，V/V)为最佳流动相，并在此条件下进行样品测定，样品色谱图(图4)说明目标峰与杂质峰分离好，通过与标样光谱图比较，峰1、2、3为亮蓝的3个同分异构体，用二极管阵列(diode array detector，DAD)光谱图定性，以异构体组合峰面积准确定量。

图2 亮蓝标样色谱图Fig.2 Chromatogram of brilliant blue standard

图3 亮蓝标样光谱图Fig.3 UV-visible absorption spectrum of brilliant blue standard

图4 紫葡萄果味饮料色谱图Fig.4 Chromatogram of purple grape fruity drink

2.3 标准曲线和方法检出限

标准物质质量浓度在0.01～0.05mg/mL时，质量浓度和同分异构体组合峰面积有良好的线性关系(图5)，线性回归方程为y＝88194762.9x－21510.2，相关系数R2＝0.9995，同时做空白试验，检出限以对应于峰1、2、3处噪音面积和的3倍计算，方法检出限为0.00004g/kg。说明方法灵敏。

2.4 加标回收率和精密度实验

按照1.2.5节、1.2.6节样品处理方法和1.2.1节色谱条件，以亮蓝标样3个同分异构体的组合峰面积进行定量，DAD光谱图定性，对6个样品(葡萄果味饮料、米花糖、绿豆饼、青苹果饮料、糖果、果冻)进行测定，结果表明葡萄果味饮料、绿豆饼、青苹果饮料、糖果和果冻检出亮蓝，含量分别为0.0113、0.0010、0.0009、0.0027g/kg和0.0010g/kg，米花糖未检出亮蓝；对葡萄果味饮料和绿豆饼平行测定6次，计算相对标准偏差，分别为2.3%和3.2%，同时以米花糖为加标基质进行加标回收实验，加标水平分别为0.01、0.02、0.03mg/mL，平行测定2次，每个水平平均回收率分别为91.1%、94.7%和94.2%。结果说明方法准确可靠。

3 结 论

本研究对GB/T 5009.35—2003进行优化改进，初步证实食品着色剂亮蓝和国家标准物质研究中心提供的标样主要为3种异构体的混合物，并不是单一的结构；建立了高效液相色谱法有效测定食品中亮蓝同分异构体的新方法。用聚酰胺层析柱净化，高效液相色谱法分离；以DAD光谱图定性，亮蓝标样异构体组合峰面积定量，对样品进行检测。该方法简单可靠、准确可行，结果令人满意。亮蓝同分异构体的分离纯化，以及其相应的毒理学问题有待进一步研究。

[1] 陈艳, 刘思洁, 李皓. 高效液相色谱法测定果冻中的合成色素[J]. 食品科学, 2007, 28(9): 487-490.

[2] 倪蓉, 杨龙彪, 张燕. 高效液相色谱法同时测定果味饮料中8种添加剂[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(10): 1196-1197.

[3] 陈夏芳, 胡浩军, 李韬. 高效液相色谱法测定肉制品中人工合成色素的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2009, 19(2): 313-314.

[4] 邢晓慧, 尹未华, 韩春菊, 等. 高效液相色谱法测定蜜饯中食用合成色素[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(10): 133-135.

[5] 陈国庆, 吴亚敏, 王 俊, 等.常用合成食品色素荧光光谱研究[J]. 光谱与光谱分析, 2009, 29(9): 2518-2522.

[6] 刘成伦, 李小庆, 王晶, 等. 偶氮类非食用色素的快速测定方法研究进展[J]. 食品科学, 2009, 30(5): 273-276.

[7] 符峰, 范会平, 秦学磊. 高效液相色谱法测定挂面中的食用合成色素[J]. 食品科学, 2010, 31(18): 325-328.

[8] 管敏亚, 张立义. 食品中5种合成食用色素高效液相色谱检测方法的探讨[J]. 中国卫生检验杂志, 2008, 18(6): 1105-1111.

[9] 蒲云霞, 王春辉, 杨建业, 等. 反相高相液相色谱法检测熟肉制品中的合成色素[J]. 中国卫生检验杂志, 2009, 19(6): 1414-1415.

[10] 邢小慧, 尹未华, 韩春菊, 等. 高效液相色谱法测定蜜饯中食用合成色素[J]. 食品研究与开发, 2007, 128(10): 133-135

[11] 陈夏芳, 胡浩军, 李韬. 高效液相色谱法测定肉制品中人工合成色素的研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2009, 19(2): 313-314

[12] 王全林, 姜海亮, 赵颖, 等. 固相萃取二极管阵列液相色谱法同时测定火腿中6种合成色素[J]. 食品科学, 2009, 30(14): 256-260.

[13] 丁秋龙, 王丽斌, 陈建新. 食用亮蓝色素之同分异构体研究[C]//第九届全国染料与染色学术研讨会暨信息发布会论文集, 2004: 76-78.

[14] GB 2760—2007 食品添加剂使用卫生标准[S].

[15] GB/T 5009.35—2003 食品中合成着色剂的测定[S].

Determination of Brilliant Blue Isomers in Food by High Performance Liquid Chromatography

LIU Liping1，HUANG Wei2，TANG Xu-wen1，PENG Gao-ying1，LIU Guo1，CHEN Lin-qiao1

(1. Institute of Product and Commodity Quality Inspection and Supervision, Huaihua Quality and Technical Supervision Bureau, Huaihua 418000, China；2. Institute of Quality Inspection and Measurement Calibration, Zhongfang County Bureau of Quality and Technical Supervision, Zhongfang 418005, China)

A new analytical method was developed for the determination of brilliant blue in food by high performance liquid chromatography (HPLC). It was preliminarily confirmed that the presence of brilliant blue in food was mixtures of its three isomers. Sample extracts were purified by polyamide column chromatography and separated on an Inertsil ODS-SP C18 (150 mm × 4.6 mm, 5 μm) column using a mobile phase made up of methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate solution. The detection wavelength was set as 629 nm. The spike recovery rates across three spike levels were in the range of 91.1%－94.7%. The method was simple and accurate.

brilliant blue isomers；high performance liquid chromatography (HPLC)；food

O658

A

1002-6630(2012)08-0221-04

2011-04-18

刘立萍(1966—)，女，高级工程师，本科，主要从事食品质量安全检验和天然产物研究。E-mail：llp3585366@163.com