茯苓总三萜对小鼠肝损伤的预防作用

张先淑，饶志刚，胡先明,*，刘 鹏

(1.重庆工贸职业技术学院，重庆 408000；2. 病毒学国家重点实验室，组合生物合成与新药发现教育部重点实验室，武汉大学药学院，湖北 武汉 430071)

茯苓总三萜对小鼠肝损伤的预防作用

张先淑1，饶志刚2，胡先明2,*，刘 鹏2

(1.重庆工贸职业技术学院，重庆 408000；2. 病毒学国家重点实验室，组合生物合成与新药发现教育部重点实验室，武汉大学药学院，湖北 武汉 430071)

目的：研究茯苓三萜对四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝损伤的治疗作用。方法：将小鼠随机分为正常组、模型组、联苯双酯组及茯苓三萜高、中、低剂量组共6组。小鼠腹腔注射CCl4橄榄油溶液造模。治疗组以高、中、低剂量(180、90、45mg/(kg·d))茯苓三萜进行灌胃，阳性药物对照组用联苯双酯滴丸(180mg/(kg·d))，皆以1g/100mL羧甲基纤维素钠溶液混悬，0.2mL/10g体质量进行灌胃；正常组与模型组以0.9%生理盐水(0.2mL/10g)体质量灌胃。最后摘眼球取血，收集血清，检测丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性；以及小鼠肝组织HE染色后做病理切片观察。结果：与模型组相比茯苓三萜治疗组能够显著降低小鼠血清中AST、ALT活性。病理切片清楚地显示茯苓三萜能够显著减轻小鼠肝损伤的程度。结论：茯苓三萜对CCl4所致的小鼠肝损伤有明显治疗作用。

茯苓三萜；小鼠；肝损伤；四氯化碳；治疗作用

茯苓为多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(schw.)wolf)的干燥菌核[1]。它为我国常用中药，是多种方药及中成药的原料，以茯苓为原料配伍的中成药有300 多种[2]。它具有利水消肿、渗湿、健脾、宁心的功效，其主要化学成分为多糖、三萜类化合物(茯苓酸、茯苓素)等。三萜类化合物具有免疫调节[3]、抗氧化[4]、抗炎症[5]、抗肿瘤[6]等活性，国内外对茯苓三萜类成分及其生物活性等方面做了一些研究。但茯苓总三萜的保肝活性未见报道。据此，本实验选用四氯化碳致小鼠肝损伤模型对茯苓总三萜的保肝作用做了初步研究。

1 材料与方法

1.1 动物

昆明种小鼠，雌性，体质量 25～28g；实验动物由武汉大学动物实验中心提供，S P F级，许可证号SCXK(鄂)2008-2004。自由饮水，摄食。

1.2 药物与试剂

茯苓总三萜(溶剂法提取)、熊果酸标品(纯度＞98%) 上海友思生物技术有限公司；联苯双酯滴丸(保肝药物) 浙江医药股份有限公司新昌制药厂；生理盐水(0.9%)、CCl4(分析纯) 江苏强盛化工有限公司；羧甲基纤维素钠(化学纯)、橄榄油(化学纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

RE-52AA旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司；722型可见分光光度计 广州市科迅实验器材有限公司；7170型全自动生化分析仪 珠海森龙生物科技有限公司；JA3103N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；16K台式离心机 珠海黑马医学仪器有限公司；XSP-6CA光学显微镜 上海团结制造厂。

1.4 方法

1.4.1 茯苓总三萜提取[7]

称取500g茯苓干燥药材，粉碎，过20目筛，加药材量6倍体积的95%乙醇浸泡 48h后过滤，回收乙醇，所得黑褐色浸膏悬浮于水中，用 250mL 乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，回收乙酸乙酯，得棕黄色浓缩液。

1.4.2 总三萜定性鉴定[7]

取20mg 总三萜溶于5mL醋酐中，加浓硫酸-醋酐(体积比1:20)5mL，观察溶液颜色变化。

1.4.3 总三萜含量测定[8]

以熊果酸为标准品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸显色法，参照文献[10]用分光光度法，按照公式(1)计算出茯苓总三萜的含量。

式中：ρ为样品液中三萜质量浓度/(g/L)；V为样品液体积/L；m为样品质量/g。

1.4.4 CCl4致小鼠肝损伤的治疗作用[9]

昆明种小鼠7 2只，雌性，随机均分为6组，每组12只。分别为茯苓三萜高、中、低剂量组，模型对照组、正常组和联苯双酯组。实验前称小鼠体质量，给药组及对照组皆从实验第1天起，每天上午腹腔注射0.2% CCl4橄榄油溶液0.1mL/10g。同日下午，给药组以高、中、低剂量分别为180、90、45mg/(kg·d)的茯苓三萜，用1g/100mL羧甲基纤维素钠混悬( 0.2 mL/10g体质量)灌胃；联苯双酯组以联苯双酯180mg/(kg·d)剂量，用1g/100mL羧甲基纤维素钠混悬灌胃，0.2mL/10g体质量；正常组与模型对照组均灌服0.9%的生理盐水，0.2mL/10g体质量。第2～4天每天上午给药同上，第4天下午再重复注射CCl41次，最后一次处理完后，所有组的小鼠都禁食不禁水。第5天上午称小鼠体质量后摘眼球取血，分离血清，用自动生化分析仪测定ALT与AST。处死动物，剖腹取肝脏与脾脏，分别称质量后，计算脏器指数；然后取肝右叶，固定于10%中性甲醛液中，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肝组织病理学改变。

1.4.5 观察指标及其方法

1.4.5.1 血清中生化指标的测定

用7170型全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)。

1.4.5.2 肝脏指数与脾脏指数的测定

处死动物，剖腹取肝脏与脾脏，分别称质量，肝脏指数(肝体比)与脾脏指数(脾体比)的测定分别按照公式(2)、(3)计算。

式中：m1为肝湿质量/g；m为体质量/g；m2为脾湿质量/g。

1.4.5.3 肝脏组织形态学观察

取肝右叶组织置于10%中性甲醛液中固定，石蜡包埋，切片，作HE染色，在光学显微镜下观察肝组织形态学变化情况。

1.4.6 统计学处理

2 结果与分析

2.1 茯苓总三萜定性分析与含量测定

2.1.1 总三萜定性鉴定

取20mg 总三萜溶于 5mL 醋酐中，加浓硫酸-醋酐(体积比 1:20) 5mL，溶液由黄变红，逐渐变紫变蓝，最后褪色。证明提取物中含有三萜类。

表2 小鼠体质量与肝脏及脾脏质量(±s，n=12)Table 2 Body, liver and speen weights of mice in each group(±s，n=12)

表2 小鼠体质量与肝脏及脾脏质量(±s，n=12)Table 2 Body, liver and speen weights of mice in each group(±s，n=12)

注：a.与模型组相比，差异显著(P＜0.05)；b. 与模型组相比，差异极显著(P＜0.01)。

组别 实验前体质量/g 实验后体质量/g 肝脏质量/g 脾脏质量/g 肝脏指数 脾脏指数正常组 27.85±9.14 28.17±21.82 1.11±0.04a 0.071±3.25×10-5 3.961±0.3341b 0.2552±0.001379模型组 27.59±9.87 27.77±25.27 1.63±0.28 0.077±0.00035 5.756±1.070 0.2744±0.0008910联苯双酯组 27.32±10.32 27.33±14.00 1.53±0.07 0.077±0.00035 5.646±0.7525 0.2586±0.006147低剂量组 25.28±14.81 26.02±20.33 1.48±0.27 0.073±0.00015 5.576±1.515 0.2810±0.0004020中剂量组 27.50±5.41 27.58±11.14 1.44±0.07 0.070±2.45×10-5 5.189±0.2665 0.2566±0.0009330高剂量组 27.54±4.77 28.04±8.93 1.46±0.08 0.070±0.00019 5.165±0.3689 0.2494±0.002025

2.1.2 总三萜含量测定

由标准曲线可得回归方程为y＝0.08390.0902(R2＝0.9993)，其中，x为样品中茯苓总三萜含量/(mg/mL)，y为吸光度。经实验测得样品液的吸光度为0.337。由上述回归方程计算得样品液中三萜含量为2.56mg/mL；三萜的百分含量为1.27%。

2.2 血清学检测

表1 茯苓三萜对小鼠血清ALT与AST活性的影响(±s，n=12)Table 1 Effect of Poria cocos triterpenes on serum ALT and AST in mice(±s，n=12)

表1 茯苓三萜对小鼠血清ALT与AST活性的影响(±s，n=12)Table 1 Effect of Poria cocos triterpenes on serum ALT and AST in mice(±s，n=12)

注：a.与模型组相比，差异极显著(P＜0.01)；b.与正常组相比，差异极显著(P＜0.01)。

组别 AST活力/( U/mL) ALT活力/( U/mL)正常组 44.00±24.96 32.22±3.95模型组 139.33±8.21b 286.56±12.15b联苯双酯组 84.00±8.50a 188.67±26.75a低剂量组 123.56±7.09a 258.00±13.40a中剂量组 116.11±9.16a 216.11±9.57a高剂量组 88.78±5.70a 207.22±21.69a

由表1可知，模型组小鼠血清AST、ALT活力较正常组明显升高(P＜0.01)，茯苓三萜各治疗组AST、ALT活力明显低于模型组(P＜0.01)，且各剂量组之间存在量效关系。

2.3 CCl4致小鼠肝损伤的脏器指数

由表2可知，正常组肝脏质量与模型组比较，差异显著(P＜0.05)，说明CCl4会使小鼠肝脏明显肿大；茯苓三萜低、中、高剂量组与模型组比较，能降低肝脏质量，但差异不显著(P＞0.05)，无统计学意义。正常组肝脏指数与模型组比较，差异极显著(P＜0.01)，说明CCl4会使小鼠肝脏指数增大；茯苓三萜低、中、高剂量组与模型组比较，能降低肝脏质量指数，但差异不显著(P＞0.05)，无统计学意义。

正常组脾脏质量与模型组比较，CCl4会使小鼠脾脏肿大，但差异不显著(P＞0.05)，无统计学意义；茯苓三萜低、中、高剂量组与模型组比较，能降低脾脏质量，但差异不显著(P＞0.05)，无统计学意义。正常组脾脏指数与模型组比较，CCl4会使小鼠脾脏指数增大，但差异不显著(P＞0.05)，无统计学意义；茯苓三萜中、高剂量组与模型组比较，能降低脾脏指数，但差异不显著(P＞0.05)，无统计学意义。

由此说明CCl4会使小鼠肝脏和脾脏肿大，使肝脏和脾脏指数增大；而茯苓三萜能适当抑制CCl4所致的小鼠肝脏和脾脏肿大。

2.4 肝组织病理切片

图1 肝脏病理切片(×100)Fig.1 Pathological analysis of liver tissues by HE staining (×100)

由图1可知，模型组小鼠肝组织镜下可见肝小叶结构稍紊乱，肝小叶内肝细胞大部分肿胀，细胞质疏松，部分肝细胞气球样变，脂肪变性，汇管区少许炎症细胞浸润，无明显坏死。对于CCl4引起的肝脏组织病理病变，茯苓三萜低、中、高剂量组能减轻肝细胞肿胀，对CCl4引起的急性肝损伤有明显的保护作用。其中茯苓三萜低剂量组使肝小叶结构有所改善，但纤维化、脂肪变性仍明显；茯苓三萜中剂量组使纤维化改善，脂肪变性仍较明显，胶原纤维间隔较少；茯苓三萜高剂量组使轻度脂肪变性且仅有少量纤维组织，小叶结构明显改善，肝小叶多呈放射状分布，汇管区结缔组织增生不明显；联苯双酯阳性对照组使细胞肿胀、气球样变、肝窦充血明显减轻。而正常组则肝组织结构正常，无脂滴、肿胀、炎症细胞浸润。

3 讨 论

运用经典的CCl4模型，同时以低、中、高剂量茯苓三萜给予治疗，通过血清学指标检测，结果发现茯苓三萜能够有效降低上述指标，表明其对受损肝脏有保护作用；另外从肝组织病理切片发现治疗组的肝纤维化病变得到改善，并且呈现剂量相关性。这为茯苓作为保肝功能的保健食品开发提供了前景。当然，已有研究[10-12]显示MMP-2是肝脏最重要的病变因子，可能参与了肝细胞变形的发生、发展。本实验只探讨了茯苓三萜抗肝损伤的作用，而它的作用机制还需通过TGF-β1mRNA及MMP-2等的表达做进一步研究。

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Preventive Effect of Triterpenes fromPoria cocoson Liver Injury in Mice

ZHANG Xian-shu1，RAO Zhi-gang2，HU Xian-ming2,*，LIU Peng2
(1. Chongqing Industry and Trade Polylechnic, Chongqing 408000, China；2. State Key Laboratory of Virology, Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery,Ministry of Education; School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430071, China)

Objective ：To explore the preventive effect of triterpenes fromPoria cocoson carbon tetrachloride-induced liver injury in mice. Methods: Kunming mice were randomly divided into normal group, model group, (dimethyl diphenyl bicarboxylate,DDB) positive control group, and low-, middle- and high-dose treatment groups. Mouse models of liver injury were created by intraperitoneal injection of CCl4. The high-, middle- and low-dose treatment groups were orally administered with triterpenes fromPoria cocosat doses of 180, 90 mg/(kg· d) and 45 mg/(kg·d), respectively. The positive control group was orally administered with DDB at a dose of 180 mg/(kg·d). Both drugs were separately suspended in 1 g/100 mL CMC-Na solution before administration and given at a level of 0.2 mL/10 g body weight. The normal and model groups were given 0.9% normal saline at a level of 0.2 mL/10 g body weight. The serum AST and ALT activities were determined and liver injury was evaluated by HE staining. Results: Compared with the model group, the three treatment groups showed significantly lower AST and ALT activities. In addition,Poria cocostriterpenes could significantly attenuate liver injury in mice. Conclusion:Poriacocostriterpenes have obvious protective effect on CCl4-induced liver injury in mice.

Poria cocostriterpenes；mice；liver injury；carbon tetrachloride；treatment efficacy

TS201.21

A

1002-6630(2012)15-0270-04

2011-07-06

国家科技部重大专项(2009ZX09301-14-1)

张先淑(1972—)，女，讲师，本科，研究方向为生物化学与天然药物学。E-mail：czqpeng@126.com

*通信作者：胡先明(1951—)，男，教授，博士，研究方向为药物化学与保健食品。E-mail：xmhu@whu.edu.cn