响应面法优化短短芽孢杆菌F M4 B的发酵培养基

芮广虎，胡雪芹*，殷 坤，张洪斌

(合肥工业大学医学工程学院，安徽 合肥 230009)

响应面法优化短短芽孢杆菌F M4 B的发酵培养基

芮广虎，胡雪芹*，殷 坤，张洪斌

(合肥工业大学医学工程学院，安徽 合肥 230009)

采用Plackett-Burman法考察发酵培养基中各组分对抗真菌活性物质产量的影响。结果表明：葡萄糖、蔗糖、K2HPO4的质量浓度对抗真菌活性物质产量影响显著。再采用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，并结合Box-Behnken响应面法对3个主要因素进行分析，得到优化的发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖6.1、蔗糖31.3、蛋白胨23.1、K2HPO4 0.825、MgSO4·7H2O 0.5。采用该法优化所得的培养基，其抑菌圈面积增加了42%。

短短芽孢杆菌；生物防治；Box-Behnken试验；响应曲面法；培养基优化

近年来，食品安全得到了人们的普遍关注。由食品安全引发的问题，已成为人类健康的主要影响因素，各国政府纷纷将保证和提高食品安全视为提高人民生活质量、保持社会稳定和经济发展的重大战略问题[1]。然而，人均耕地面积日渐减少，要求提高单位面积作物产量，最大程度地减少病虫害，导致大量使用化学农药对农作物进行保护。化学农药的广泛使用，污染和破坏了生态环境，带来了严重的后果，食品中残留农药的毒害事故频频发生。因此，控制与消除化学农药污染，开发与环境和谐的生物防治方法，已成为环境保护的一个热点问题。

农作物的枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的土传真菌性病害，难防难治。国内外已有大量生物防治农作物病虫害的相关报道。据报道[2-5]，芽孢杆菌(Bacillusspp.)是一类在自然界中广泛存在的微生物，可产生抗生素、细菌素、抗菌蛋白等多种抗菌物质。这类细菌多为革兰氏阳性菌，可以形成芽孢，细胞壁不含内毒素，对人畜无害[6]，是非常有价值的生防菌。

本实验室从西瓜植株根际周围筛选到一株拮抗菌FM4B，经鉴定为短短芽孢杆菌，离体条件下，其发酵液对多种枯萎病病菌的生长有很强的抑制作用，前期实验表明该菌及发酵液能降低西瓜枯萎病发病率，并能促进西瓜植株的生长[7]。因此，具有很好的研究价值及开发前景。为了提高抗枯萎病菌活性物质产量，本实验采用响应面法对发酵培养基进行优化，可以快速地从众多的试验因素中挑选出影响显著的因素，对显著因素做进一步的优化，得出最优的培养基组成。

1 材料与方法

1.1 菌株

供试生防菌为短短芽孢杆菌Brevibacillus brevisFM4B菌株，由本实验室提供；活性指示菌为西瓜枯萎病菌Fusariurn oxysporumf.sp.niveum，由上海交通大学提供。

1.2 仪器与设备

SL202N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅 江苏金坛市晶玻实验仪器厂；KQ-500型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HQ45B型恒温摇床 中国科学院武汉科学仪器厂；SPX-150B型生化培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 培养基与培养条件

PDA培养基(g/L)：葡萄糖20、土豆200、琼脂18，pH值自然。斜面培养基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、琼脂18，pH7.0，28℃培养24h。种子培养基和发酵培养基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨23.1、K2HPO40.1、MgSO4·7H2O 0.5，pH7.5。

培养条件：从斜面上挑取3环接种到含50mL种子培养基的250mL锥形瓶里，30℃、200r/min培养15h，得种子液。按5%的接种量接种到装有50mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，28℃、180r/min培养21h，离心除菌体，得活性物质发酵液。

1.4 抗真菌活性的测定方法

抗真菌活性的测定采用杯碟法，以没有指示菌生长的区域面积来表示抗菌活力。300μL指示菌孢子悬液(105CFU/mL)与50℃的20mL PDA培养基混合摇匀后倒平板。在凝固的平板上打孔(直径6mm)，每孔中加入活性物质发酵液100μL，28℃培养48h，观察并计算抑菌圈面积。

1.5 方法

1.5.1 Plackett-Burman试验设计

根据预实验研究的结果[8]， FM4B菌株的发酵培养基成分主要有：葡萄糖、FeSO4·7H2O、蔗糖、黄豆饼粉、蛋白胨、NH4NO3、酵母膏、K2HPO4和MgSO4·7H2O。采用Plackett-Burman试验设计[9-10]，见表1，拟合方程为：Y＝γ0＋γ1X1＋γ2X2＋γ3X3＋γ4X4＋γ5X5＋γ6X6＋γ7X7＋γ8X8＋γ9X9

表1 Plackett-Burman试验分析因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.5.2 最陡爬坡试验设计

对Plackett-Burman试验的因素作显著性分析，找出主要因素。根据拟合函数回归系数的符号和大小来设计主要因素的最陡上升路径，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值。试验组数由经验来定，步长由主要因素的效应值确定。通过使主要因素同时朝响应值增大的方向变化，找出峰值，从而逼近最大的响应区域[11-12]。

1.5.3 Box-Behnken试验设计[11]

根据1.5.1、1.5.2节的实验结果，用SAS (Version8.1)进行响应面试验设计并对试验数据进行回归性分析，用t检验验证回归系数的显著性，用F检验评价模型方程的显著性，方程的拟合性由R2确定。

1.6 模型验证

用SAS(Version8.1)对多元函数进行拟合和方差分析。对自变量求偏导数，可确定出其极值点[10]。再按照计算所得到的参数进行验证实验，以检验模型的重复性和可靠性。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验对主要因素的筛选

采用Plackett-Burman法，对9个组分进行考察。每个组分取高水平(＋1)和低水平(－1)，见表2。各组分所代表的高低水平和方差分析结果，见表3。

表2 Placket-Burman设计与响应值Table2 Placket-Burman design and corresponding results

表3 各因素影响的主效应分析Table 3 Main effects analysis of medium components

由表3可知，培养基组分对活性物质产量的影响显著性[13]的排序为：葡萄糖＞蔗糖＞K2HPO4＞FeSO4·7 H2O＞黄豆饼粉＞酵母膏＞蛋白胨＞N H4N O3＞MgSO4·7H2O。显然，葡萄糖、蔗糖和K2HPO4的影响较为突出，葡萄糖对于菌体产抑菌物质呈现负效应，蔗糖和K2HPO4呈正效应。这些效应关系用方程式表示为：Y＝337.1667－62.5X1＋53.83333X3＋40.83333X8，方程R2＝0.9618，表明该回归方程拟合良好。从方程中还可以看出，要提高产量，应适当降低葡萄糖质量浓度，提高蔗糖和K2HPO4质量浓度。

2.2 最陡爬坡试验研究最大响应值的响应区域

根据Plackett-Burman试验设计法筛选出的主要组分的效应大小设计它们的步长，进行最陡爬坡试验设计，寻找最大产量区。试验设计及结果如表4所示。最大产量区在试验号2附近。

表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Steepest ascent procedure and corresponding results

2.3 Box-Behnken试验优化培养基成分

表5 响应面分析试验因素水平表Table 5 Factors and levels of response surface analysis

根据最陡爬坡试验结果，以试验号2的条件为响应面试验因素水平的中心点。响应面试验因素水平设计见表5。采用Box-Behnken响应面试验设计确定主要因素的最优水平，试验设计及结果见表6。SAS(Version8.1)拟合出的回归方程模型为：Y＝395.3333－19.75x1＋7.75x2－11x3－13.16667x12－4.5x1x3＋12.16667x22＋8.5x2x3－9.166667x32。回归方程的方差分析见表7。

表6 Box-Behnken响应面设计和对应结果Table 6 Box-Behnken design and corresponding response values

表7 回归模型的方差分析Table 7 Analysis of variance for the proposed quadratic polynomial model

方程自变量平方项的符号皆为负值，则抛物线的开口向下，所以有对应的极大值点[10]。由方差分析得出大于F值的概率为0.003877，表明回归方程模型的显著性及可靠性很好；而且方程R2＝0.9651，表明了响应模型可以解释96.51%的总体变异情况，只有3.49%的变异无法用模型来解释[14-16]，回归模型有高度的相关性[17]。这个模型可以用于活性物质产量的分析和预测。联合响应面回归分析和回归方程绘制的响应面图形如图1～3所示。

图1 x1与x2交互作用对Y值预测响应面图和等高线图Fig.1 Response surface plot and contour plot of Y versus x1 and x2

图2 x2与x3交互作用对Y值预测响应面图和等高线图Fig.2 Response surface plot and contour plot of Y versus x2 and x3

图3 x1与x3对Y值预测响应面图和等高线图Fig.3 Response surface plot and contour plot of Y versus x1 and x3

通过观察上述图形的变化趋势得出：x1、x2、x3在试验范围内存在极大值点。这3个组分的最优试验点(x1,x2,x3)为(0.917, 0.500, 0.000)，即葡萄糖6.1g/L、蔗糖31.3g/L、K2HPO40.825g/L，在此点预测的抑菌圈面积为403mm2；x1x2交互作用的等高线近似圆形，则两者的交互作用不显著；x2x3和x1x3交互作用的等高线都是椭圆，则两元素间的交互作用显著[18]。

2.4 验证实验

为了检验模型预测的准确性，在优化条件下进行3组装液量为50mL/250mL的发酵实验，所测的抑菌圈面积都在400mm2以上，平均值为405mm2。与模型预测值非常接近，表明设计模型能很好的预测实际的发酵情况。

3 结 论

SAS全称为Satistics Aalysis System，它是包括数据的统计分析、运筹等为题的科学计算等大量模块的集成软件系统。Plackett-Burman试验设计法的优越之处在于试验次数少，周期短，精度高[19]，从众多的考察因素中挑选出影响试验的几个主要因素，以供进一步的深入研究[20]。响应面法可以对影响生物产量的主要因素的含量和它们间的交互作用进行优化和评价，确定出多因素体系的最优解。

本研究通过采用Plackett-Burman试验设计，对影响菌株FM4B代谢产生抗菌活性物质的9个组分进行了评价和分析，筛选出葡萄糖、蔗糖、K2HPO4为影响产量的主要因素。然后根据Box-Behnken响应面试验设计原理，确定了培养基的最优组分为(g/L)：葡萄糖6.1、蔗糖31.3、蛋白胨23.1、K2HPO40.825、MgSO4·7H2O 0.5。发酵液的抑菌圈面积由原来的285mm2提高到405mm2，增加了42%，进一步提高了FM4B菌株的抑菌活性。

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Medium Optimization for Antifungal Substance Production byBrevibacillus brevisFM4B Using Response Surface Methodology

RUI Guang-hu，HU Xue-qin*，YIN Kun，ZHANG Hong-bin
(School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of 9 medium components on the production of antifungal substance byBrevibacillus brevisFM4B. The results showed that glucose, peptone and K2HPO4 were the most important medium components. Steepest ascent procedure and response surface methodology based on Box-Behnken experimental design were employed to optimize the three medium components. The optimal fermentation medium for producing antifungal substance was composed of glucose 6.1 g/L, peptone 23.1 g/L, sucrose 31.3 g/L, K2HPO4 0.825 g/L and MgSO4·7H2O 0.5 g/L. The inhibition spot area of the optimized culture medium after fermentation withBrevibacillus brevisFM4B was increased by 42% compared to that of the original medium.

Brevibacillus brevis；biological control；central composite design；response surface methodology；medium optimization

S432.4

A

1002-6630(2012)15-0257-05

2011-06-16

合肥工业大学大学生创新性实验计划项目(2010052)

芮广虎(1983—)，男，硕士研究生，研究方向为生物制药工程。E-mail：ruiguanghu2008@163.com

*通信作者：胡雪芹(1976—)，女，副教授，研究方向为微生物制药。E-mail：huxueqin12345@163.com