HPLC法同时测定蓝莓汁及其发酵酒中9种有机酸

胡小露，刘 卉，鲁 宁，刘 佳，高学玲,*

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2.安徽省食品安全分析与检测省级实验室，安徽 合肥 230036)

HPLC法同时测定蓝莓汁及其发酵酒中9种有机酸

胡小露1,2，刘 卉1，鲁 宁1，刘 佳1，高学玲1,2,*

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2.安徽省食品安全分析与检测省级实验室，安徽 合肥 230036)

采用高效液相色谱法测定蓝莓汁及其发酵酒中有机酸含量。色谱条件为：色谱柱：Waters symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：NH4H2PO4(4g/100mL)溶液(磷酸调pH值为2.0)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：室温。通过该方法检测蓝莓汁及其发酵酒中9种主要有机酸：草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸，其平均回收率为99.52%，平均相对标准偏差为0.019%。

高效液相色谱；蓝莓汁；蓝莓酒；有机酸

蓝莓，杜鹃花科(Ericaceae)，越桔属(Vacciniumspp.)[1]，其果实中富含花色素苷[2-4]、酚酸[5-6]、有机酸等多种有效成分，具有降脂、抗癌、延缓衰老、防止血管瘤的发生、治疗糖尿病、改善血液循环等功效[7-9]，其中有机酸不仅直接影响果汁及其果酒的感官品质，同时对花色苷等物质还具有保护作用。蓝莓汁及其发酵酒中的有机酸有原料带来的，也有发酵中代谢产生的，其有机酸的种类及含量因品种及其发酵方式不同而不同。

目前，有机酸含量的检测方法较多[10-16]，但关于蓝莓及其制品中多种主要有机酸的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)同时测定尚未见文献报道。本实验利用气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)定性检测蓝莓汁中几种主要有机酸，再利用HPLC通过等度洗脱方法定量检测蓝莓汁及其发酵酒中主要有机酸含量，可有效地跟踪蓝莓汁及蓝莓酒发酵过程中有机酸含量及其变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓 安徽怀宁蓝莓种植基地，于－20℃冻藏；果胶酶(食品级，酶比活力18000U/g) 烟台通商国际贸易有限公司；活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸对照品(纯度＞99%) 上海精纯试剂有限公司；甲醇(色谱纯) 美国Tedia公司；磷酸二氢铵(分析纯) 天津巴斯夫化工有限公司。

1.2 仪器与设备

600高效液相色谱仪 美国Waters公司；FA1104N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TGL-16G台式离心机 上海安亭科学仪器厂；PHS-3C型pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 样品的制备方法

1.3.1 标准溶液制备

分别称取草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸对照品50.0mg，用去离子水定容至10mL，配制成5g/L标准液，根据样品中有机酸含量分别稀释，经0.45μm滤头过滤进样。以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 样液的制备

取1mg/L蓝莓原汁100μL，－80℃预冻，冷冻干燥24h，采用衍生化试剂双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)＋三甲基氯硅烷(TMCS)对样品进行衍生化处理，置120℃干燥50min，待GC-MS定性分析。

2mL蓝莓原汁或蓝莓酒，经15000r/min离心20min，0.45μm滤头过滤，待HPLC定量分析。

1.3.3 蓝莓酒的发酵工艺流程

蓝莓打浆→果胶酶酶解→取汁→糖、酸调整→接酵母菌→22℃发酵→蓝莓酒

1.4 HPLC色谱条件

色谱柱：Waters symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)；流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样体积5μL；检测波长：210nm；流动相：NH4H2PO4(4g/100mL)溶液，磷酸调pH值为2.0。

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线的建立

分别吸取一定质量浓度的有机酸对照品，过滤后进样。以进样量/(mg/L)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线，见表1，结果表明色谱工作稳定，重现性良好。

表1 9种有机酸的标准曲线方程Table 1 Regression equations of nine organic acids

2.2 GC-MS图谱分析

2.2.1 GC-MS定性分析

按照1.3.2节方法对样品进行预处理，采用GC-MS对蓝莓汁中主要有机酸进行检测，结果见图1。蓝莓汁中的草酸、柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸，其出峰时间分别为6.925、24.467、28.825、29.042min。

图1 蓝莓汁中主要有机酸的GC-MS图Fig.1 GC-MS chromatogram of nine major organic acids in blueberry juice

2.2.2 HPLC定量分析

实验选取不同浓度草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸9种有机酸制作混合标准溶液，混合标准溶液色谱图见图2A；同时检测蓝莓汁及其发酵酒样，见图2B、C。可知，9种有机酸的色谱峰分离度较高。

图2 有机酸对照品(A)、蓝莓汁样品(B)和蓝莓酒样品(C)HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of standard organic acids (A),blueberry juice (B) and blueberry wine (C)

2.3 精密度实验

取9种有机酸对照品的混合溶液10mL，按1.4节色谱条件连续进样6次，分别计算有机酸峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，其平均RSD为0.15%(n＝6)。表明该仪器灵敏度高，可用于蓝莓酒中有机酸的检测。

2.4 重复性实验

精密吸取一定量的蓝莓酒样品6份，经离心、过滤处理后进样分析，分别计算有机酸峰面积的相对标准偏差，得到平均RSD为0.35%(n＝6)，表明该检测方法重现性良好。

2.5 加标回收率实验

采用加样回收法，精确吸取一定量的蓝莓酒样品5份，分别加入一定浓度的有机酸对照品，经离心、过滤处理后进样检测，记录色谱图，根据峰面积计算回收率，结果见表2，其中有机酸平均回收率为99.52%，平均RSD为0.019%(n＝5)。可见此方法的准确度和精密度均良好，可应用于蓝莓果酒中有机酸含量的检测。

2.6 方法的验证

为进一步验证方法的可靠性，采用此方法跟踪检测了不同发酵时期蓝莓酒的有机酸含量，结果见图3。对发酵结束后的蓝莓酒每隔10d连续取样4次，采用该方法检测这不同时期蓝莓酒中有机酸的含量，分离效果均较好，目标峰出峰前后无杂质峰干扰，在样品有机酸浓度较低的情况下，杂质峰也未干扰目标物的检测，且主要有机酸目标峰出峰时间稳定、峰形尖锐、分离度高。

图3 不同发酵时期蓝莓酒有机酸系列图谱Fig.3 HPLC chromatogram of blueberry wine fermented for different days

表2 方法回收率测定结果Table 2 Recovery rates of this method for 9 organic acids

3 讨论与结语

采用衍生化方法前处理样品[17-19]，利用GC-MS法对蓝莓汁中有机酸进行检测时，只检测出草酸、苹果酸、异柠檬酸、柠檬酸4种主要有机酸，酒石酸未被检出，可能是在样品的低温处理过程中，酒石酸以钾盐等形式析出而导致含量低于检测限而未被检测出。结合相关文献[14-16]及GC-MS定性分析结果，选取草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸9种有机酸作为检测目标，分析蓝莓及其发酵酒的有机酸的含量。HPLC法测定蓝莓汁及其蓝莓酒中的有机酸含量时，由于各种有机酸的洗脱速度相近，导致出峰时间间隔小，实验通过调整流动相组成及配比达到了分离效果。通过调整流动相NH4H2PO4的质量浓度为4g/100mL，pH2.0时可达到较为理想的分离效果。

采用流动相：NH4H2PO4(4g/100mL)溶液(磷酸调pH值为2.0)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：25℃；色谱柱：Waters symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)。通过该方法，蓝莓酒中含有的九种主要有机酸：草酸、酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸得到有效的分离并定量，其平均回收率为99.52%，平均RSD为0.019%。结果显示，该方法操作简单，准确度高，无杂质干扰，蓝莓酒样品无需经过复杂的前处理，即可达到良好的分离效果。

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Determination of 9 Organic Acids in Blueberry Juice and Wine by HPLC

HU Xiao-lu1,2，LIU Hui1，LU Ning1，LIU Jia1，GAO Xue-ling1,2,*
(1. College of Tea and Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China ；2. Key Laboratory of Analysis and Detection Technology for Food Safety, Hefei 230036, China)

A simple HPLC method was developed to determine organic acids (oxalic, tartaric, malic, isocitric, shikimic, lactic,acetic, citric and succinic acids) in blueberry juice and wine. The HPLC separation was achieved on C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at room temperature. The mobile phase (pH 2.0) was 4% NH4H2PO4 at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set as 210 nm. The average recovery rate of this method was 99.52% with RSD of 0.019%.

HPLC；blueberry juice；blueberry wine；organic acid

O657.7

A

1002-6630(2012)16-0229-04

2011-07-26

胡小露(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：355507989@qq.com

*通信作者：高学玲(1967—)，女，副教授，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：1223799045@qq.com