动物尿液中沙丁胺醇残留快速检测

伍 季，尹红娜*，竹 磊，吕 微

(1.河南省食品质量安全控制工程技术研究中心，河南 郑州 450002；2.河南省商业科学研究所有限责任公司，河南 郑州 450002)

动物尿液中沙丁胺醇残留快速检测

伍 季1,2，尹红娜2,*，竹 磊1，吕 微1

(1.河南省食品质量安全控制工程技术研究中心，河南 郑州 450002；2.河南省商业科学研究所有限责任公司，河南 郑州 450002)

探索一种动物尿液样品沙丁胺醇残留的快速检测方法。分别研究提取溶剂、β-环糊精与小分子醇的协同增敏作用和pH值对检测结果的影响，对该方法的选择性、线性方程、精密度和回收率以及检出限进行考察。结果表明：最佳提取溶剂为异丁醇，β-环糊精浓度为5mmoL/L，添加4%(V/V)的乙醇之后，能够明显增加沙丁胺醇荧光强度，最佳pH9；该方法的精密度相对标准偏差、回收率以及检出限分别为0.13%、96.57%、0.8μg/L。该动物尿液中沙丁胺醇残留的荧光光度检测方法，整个过程只需10～15min，操作方便，适合于现场检测。

沙丁胺醇；残留；动物尿液；荧光光度法；快速检测

沙丁胺醇(salbutamol，SAL)属于β2-兴奋剂的一种，化学名称为1-(4-羟基-3-羟甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，是一种能与β2-肾上腺素能受体结合的药物，临床主要用于治疗哮喘、支气管痉挛等[1]。将SAL作为饲料添加剂使用，能显著促进动物生长，增加饲料转化率和瘦肉率[2-3]，长期超量使用，则会在动物组织中蓄积，人过量使用这种动物产品后会引发中毒。

随着对“瘦肉精”的监察和检测力度的增大，一些非法使用者开始转向其他替代品。由于沙丁胺醇的结构与“瘦肉精”相似，所以其具有相似的作用[4]；又因为SAL在动物体内消除的时间较短、毒性较弱，因此SAL就成为“瘦肉精”最主要的替代品[5]。药物在动物体内，随着尿液生成过程中的浓缩，尿药浓度逐渐升高，大多远远高出血药浓度，因此易于测定[6]；其次，尿液也可无损伤收集，这也是在检测药物浓度时通常选尿液为检测标本的原因；此外，检测动物尿液中的药物含量，适用于动物的宰前控制，可有效地预防药物残留超标的动物性食品流入市场，对保障动物性食品的安全具有重大意义。

目前，国内外对SAL检测方法的研究还处于起步阶段，国内还没有关于动物体内SAL残留检测统一的国家标准。现行的检测方法也很多，有沙丁胺醇的检测方法主要有高效液相色谱-质谱联用法(high-performance liquid chromatography-mass spectrometer，HPLC-MS)[7-9]、气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[10-12]、高效液相色谱法(HPLC)[13-16]和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[17-18]等。但这些方法从抗干扰、定量的准确程度以及检测时间方面都存在一定的问题[19]。

本实验旨在对以猪尿为代表的动物尿液前处理手段进行研究，建立一种快速、准确的荧光光度检测方法，此方法具有灵敏度高(检出限为10-4～10-6g/L)，选择性强、用样量少、操作简便等优点[20]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

动物尿液(猪尿) 郑州市屠宰厂。

沙丁胺醇标准品 中国食品药品检定研究院；所用试剂均为分析纯；实验用水为亚沸蒸馏水。

AnkeTGL-16c离心机 上海安亭科学仪器厂；F-850型荧光光度计 日本日立公司；PHS-2C型精密酸度计上海大普仪器有限公司；AL204-IC型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 方法

因为尿液中所含的干扰成分含量较小，所以在以尿液为检测标本时，大都直接进行检测，不需再做其他处理。本项目中对尿液样品检测时，发现尿液样品一般为黄色，影响检测，所以需对尿液提取后进行检测。

在Ex/Em波长为280nm/310nm的条件下检测所涉及的各种溶剂、提取液。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

由于SAL的Ex/Em波长为280nm/310nm[21]，为了避免干扰，所选溶剂在280nm/310nm处的荧光强度值要小。依据资料选择几种对SAL溶解性较好的溶剂进行选择——异丁醇、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、丙酮、异丁醇＋乙酸乙酯、异丙醇＋乙酸乙酯，对其做荧光波谱扫描，从抗干扰情况来看，较为合适的溶剂为乙酸乙酯、异丁醇和正丁醇。

除了抗干扰因素，最佳提取溶剂还将由其提取率确定。根据以上结果，取3份10mL 5mg/L SAL溶液，分别加入等体积的乙酸乙酯、正丁醇和异丁醇溶剂萃取，分离出有机层，干燥后在280nm/310nm测其荧光强度值(I)，分别与空白溶剂的荧光强度值比较，差值越大则证明其提取率越高，结果见表1。

从表1可看出，异丁醇的提取率较高，说明异丁醇对SAL的荧光强度值影响最小，所以最终确定异丁醇作为提取溶剂。

表1 最佳提取溶剂的选择Table 1 Screening of optimal solvent for SAL extraction

2.2β-环糊精(β-CD)与小分子醇的协同增敏作用

尿液组成比较复杂，用异丁醇直接提取后效果不理想，可能是由于尿液中有其他物质导致SAL荧光猝灭。本实验采用β-CD来屏蔽一部分干扰。β-CD具有一个高为0.79nm、直径为0.60～0.65nm的筒状空腔，这种特殊的分子结构赋予β-CD与其极性相似、分子大小与其空腔相匹配的不同类型的分子均能形成包络物的特性。

尿液经异丁醇提取后，分出上层有机层，加入1mLβ-CD，利用其空腔屏蔽掉一些能够导致荧光猝灭的因素，取得了一定的效果。实验研究了β-CD在浓度为1～10mmol/L范围内的效果。结果表明，在选定β-CD浓度为5mmol/L时，β-CD的效果最好(图1)。

图1 β-CD浓度与荧光强度的关系Fig.1 Effect of β-CD concentration on fluorescence intensity

同时，对甲醇、乙醇、正丁醇、异丁醇与β-CD协同增敏作用进行研究发现，在添加了4%(V/V)的乙醇溶液之后，能够明显增加SAL荧光强度(图2)。

图2 小分子醇对β-CD的增敏效果Fig.2 Enhancing effect of alcohols on β-CD efficacy for resisting interferences

2.3 pH值对测定结果的影响

实验过程中发现pH值在实验中起着非常重要的影响，影响到异丁醇提取效果。实验讨论了pH值为2～11的异丁醇提取沙丁胺醇的回收率，结果表明，在pH9的时候，异丁醇有最佳提取率。

图3 pH值对荧光强度和回收率的影响Fig.3 Effect of pH on recovery rate and fluorescence intensity

2.4 本方法选择性考察

取7份空白尿液，按照样品前处理方法处理后，在选定的激发光和发射光波长下测定其荧光值分别为1.871、1.871、1.870、1.871、1.870、1.871、1.871。此外，表1中异丁醇空白溶剂在Ex/Em波长为280nm/310nm时的吸收值为1.831，证明在所选定的实验条件下，经处理尿液中的物质不影响实验的测定。

2.5 本方法的线性范围考察

分别配制10mL 0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的SAL溶液，加入1mL 5mmol/L的β-环糊精和4%(V/V)的乙醇后，在Ex/Em为280nm/310nm处测其荧光强度值，结果发现在0～20.0mg/L之间质量浓度与荧光强度值呈线性关系。线性方程为y＝1.1971x＋1.8655，相关系数为0.9999。

图4 SAL质量浓度与荧光强度的线性关系Fig.4 Linear relationship between SAL concentration and fluorescence intensity

2.6 精密度和回收率

取21份尿样，分为3组，向每份样品中分别添加沙丁胺醇储备液，使添加量为0.05、1.0、10.0mg/L，经前处理步骤处理后，调整pH9，加入5mmol/Lβ-CD 1mL和4%(V/V)的乙醇，测其荧光强度值，计算相对标准偏差(relative sandard deviation，RSD)和平均回收率，结果见表2。

表2 尿液精密度和回收率实验结果Table 2 Recovery rates and precision for the determination of SAL in urine

2.7 检出限

测定20次尿样空白，求得标准偏差(Sb)为0.000308，依据国际纯粹与应用化学协会(International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)的建议，计算检出限CL＝KSb/m。式中：CL为检出限；Sb为空白多次测得信号的标准偏差；K为根据一定置信水平确定的系数；m为分析标准曲线在低浓度范围内的斜率。测定20次空白，系数K＝3、m＝1.19711，因此此方法的检出限为0.8μg/L。

3 结 论

本实验得出尿液最佳处理方法是取10mL尿样，用0.01mol/L NaOH溶液将其pH值调至9，用60mL异丁醇提取，加入1mL 5mmol/Lβ-环糊精和4%(V/V)的乙醇后，浓缩至10mL，在Ex/Em为280nm/310nm处检测其荧光强度值。

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Rapid Detection of Salbutamol Residue in Animal Urine

WU Ji1,2，YIN Hong-na2,*，ZHU Lei1，LWei1
(1. Henan Food Quality and Safety Control Engineering Research Center, Zhengzhou 450002, China；2. Henan Commerce Science Institute Co. Ltd., Zhengzhou 450002, China)

In order to explore a rapid method for the determination of salbutamol (SAL) residues in animal urine, the impacts of extraction solvent,β-CD concentration for synergistic sensitization with small alcohol molecules and pH on determination results were explored. The optimal extraction solvent was isobutanol, aβ-CD concentration of 5 mmol/L was found optimal,and under these conditions, the fluorescence intensity of SAL was enhanced remarkably by adding 4% ethanol. The optimal pH was 9. The precision (RSD), recovery rate and detection limit of this method were 0.013%, 96.57% and 0.8 μg/L, respectively.The whole course of SAL determination by this method could be completed within 10－15 min. This method was simple, efficient,and suitable for thein situdetermination of SAL residue.

salbutamol (SAL)；residue；animal urine；fluorescence method；rapid detection

O657.3；TS207.3

A

1002-6630(2012)16-0208-04

2011-07-15

河南省预研项目(0641190102)

伍季(1956—)，男，高级工程师，本科，主要从事食品安全研究。E-mail：zzwuji@sina.com

*通信作者：尹红娜(1979—)，女，工程师，硕士，主要从事食品质量安全检测研究。E-mail：nana0705@163.com