枣核总黄酮的微波辅助提取工艺优化

张吉祥，欧来良

(1.廊坊师范学院化学与材料科学学院，河北 廊坊 065000；2.南开大学 生物活性材料教育部重点实验室，天津 300071)

枣核总黄酮的微波辅助提取工艺优化

张吉祥1，欧来良2

(1.廊坊师范学院化学与材料科学学院，河北 廊坊 065000；2.南开大学 生物活性材料教育部重点实验室，天津 300071)

目的：采用正交试验法，优选枣核中总黄酮的微波辅助提取工艺。方法：以芦丁为对照品，采用分光光度法进行测定，以枣核黄酮提取率作为考查指标，对影响黄酮提取工艺的因素进行研究。通过单因素试验研究微波功率、提取时间、提取温度、料液比和提取溶剂乙醇体积分数对提取效果的影响。然后，利用正交试验法优化最佳提取工艺条件。结果：对枣核黄酮提取的影响程度大小顺序为料液比＞提取温度＞提取时间＞乙醇体积分数＞微波功率，正交试验结果表明最佳提取工艺参数为料液比1:60(g/mL)、提取温度60℃、乙醇体积分数50%、提取时间20min、微波功率500W。在最佳工艺条件下，枣核黄酮粗品的提取产率为10.14%，粗品中黄酮含量为7.00%。结论：采用正交试验-微波提取工艺，能显著提高枣核黄酮的提取效率，具有较好的提取效果。

正交试验法；微波；提取；枣核；总黄酮

红枣，又名中华大枣、小枣，是鼠李科枣属植物枣(Zizyphus jujuba Mill)的果实[1]。红枣果肉营养丰富且含大量生物活性成分，如大枣皂甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(ziziphus saponin Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)、酸枣仁皂甙B(jujuboside B)、光千金藤碱(stepharine)、葡萄糖、果糖、蔗糖、环磷腺苷(cAMP)、环磷乌苷(cGMP)等，具有独特的营养和药用价值[2-5]。目前，除对枣肉中有效成分进行研究外，以往作为废料丢弃的枣核中有效成分的研究也成为人们关注的课题[6-9]。研究表明，红枣枣核含黄酮类有效成分，具有预防心脑血管疾病、防癌抗癌之功效[9-10]。目前，天然产物中有效成分的传统提取方法有醇渗漉法、浸渍法、索氏抽提法和加热回流法。但这些提取方法存在提取时间长、溶剂用量大、提取率低等问题。近年来，现代提取技术微波辅助提取法在环境、生化、食品及天然产物等领域得到了广泛的应用。微波提取具有设备简单、操作时间短、热效率高等优点，已广泛用于天然产物中挥发油、苷类多糖、生物碱等成分的提取[11-14]。经查阅，采用微波辅助法对红枣枣核中黄酮类有效成分进行提取的报道甚少[15]。本实验以红枣核为试验材料，采用正交试验法，利用微波辅助提取法对红枣核中的总黄酮进行提取研究，旨在获得最佳提取工艺，为红枣核的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁标准品 中国食品药品检定研究院；红枣枣核样品 河北沧州金丝小枣枣核 河北献县海英枣业有限公司；乙醇(分析纯)、氢氧化钠(分析纯) 天津市北方天医化学试剂厂；三氯化铝(分析纯) 天津市虹迪化工有限公司；亚硝酸钠(分析纯) 天津市化学试剂一厂。

1.2 仪器与设备

XH100B电子微波催化合成/萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司；UV-2550型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；FA1604N电子天平 上海精密科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；RE-52A型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；ZK-82B型真空干燥箱 上海实验仪器总厂；溶剂过滤器 天津津腾实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

以芦丁为对照品，配制系列标准溶液，在波长507nm处测定吸光度，以吸光度对质量浓度做标准曲线[16]。芦丁对照品溶液在一定质量浓度范围内与吸光度呈良好线性关系，线性回归方程为A＝0.01925+13.82c，线性相关系数为r＝0.9999，标准曲线的线性范围为0.0032～0.048mg/mL。

1.3.2 提取工艺与提取效果衡量指标

枣核 → 洗净烘干 → 粉碎过200目筛 → 加入提取剂 →微波提取 → 0.45μm微孔滤膜过滤得澄清透明液体 → 减压浓缩回收提取剂 → 真空干燥 → 得枣核黄酮提取物粗品 → 计算粗品提取产率 → 测定粗品中黄酮含量。

取一定体积经微孔滤膜过滤后的溶液，按1.3.1节步骤测定波长507nm处吸光度，计算溶液质量浓度，转化为以枣核原料为基准的黄酮提取率，作为提取效果的衡量指标。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 料液比的选择

准确称取6份粉碎的枣核样品各1.0000g置于250mL圆底烧瓶中，分别加入体积分数为50%的乙醇溶液20. 00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00mL作为溶剂，设定微波功率400W，微波辐射温度40℃，提取时间20min，进行微波提取。浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液按1.3.1节操作步骤测定，计算黄酮提取率作为提取指标。

1.3.3.2 乙醇体积分数的选择

准确称取6份粉碎的枣核样品各1.0000g置于250mL圆底烧瓶中，分别加入40.00mL乙醇溶液作为溶剂，控制乙醇体积分数为20%、30%、40%、50%、60%、70%，设定微波功率400W，微波辐射温度40℃，提取时间20min，进行微波提取。浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.3.1节操作步骤测定，计算黄酮提取率作为提取指标。

1.3.3.3 提取时间的选择

准确称取6份粉碎的枣核样品各1.0000g置于250mL圆底烧瓶中，加入40.00mL 50%的乙醇溶液作为溶剂，设定微波功率400W，微波辐射温度40℃，分别控制提取时间10、15、20、25、30、35min进行微波提取。浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.3.1节操作步骤测定，计算黄酮提取率作为提取指标。

1.3.3.4 微波功率的选择

准确称取6份粉碎的枣核样品各1.0000g置于250mL圆底烧瓶中，加入40.00mL 50%的乙醇溶液作为溶剂，设定微波功率分别为200、300、400、500、600、700W，微波辐射温度40℃，微波提取20min，浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.3.1节操作步骤测定，计算黄酮提取率作为提取指标。

1.3.3.5 提取温度的选择

准确称取6份粉碎的枣核样品各1.0000g置于250mL圆底烧瓶中，加入40.00mL 50%的乙醇溶液作为溶剂，设定微波辐射温度分别为30、40、50、60、70、80℃，微波辐射温度400W，微波提取20min，浸提液经减压抽滤，取一定体积溶液并按1.3.1操作步骤测定，计算黄酮提取率作为提取指标。

1.3.4 枣核总黄酮的微波辅助提取工艺正交优化试验

在单因素试验的基础上，利用正交试验法以料液比、乙醇体积分数、微波功率、提取时间和微波辐射温度作为5个考察因素，选取4个水平进行试验。采用L16(45)正交表进行正交试验设计，确定微波提取的最佳工艺条件。

1.4 枣核黄酮粗品提取产率的计算

将浸提液减压浓缩回收溶剂，将产品真空干燥得枣核黄酮粗品，计算粗品的提取产率。

式中：ω为枣核黄酮粗品提取产率/%；X为枣核黄酮提取物粗品质量/g；m为枣核质量/g。

1.5 枣核黄酮粗品中黄酮含量的计算

准确称取一定质量的黄酮粗品，溶解并定容至25mL容量瓶中，取一定体积溶液并按1.3.1节方法测定吸光度，将吸光度换算成质量浓度，计算枣核粗品中黄酮含量。

式中：w为枣核粗品中黄酮含量/%；c为溶液中黄酮质量浓度/(mg/mL)；V为所取溶液体积/mL；M为枣核粗品质量/g。

2 结果与分析

2.1 枣核总黄酮的微波辅助提取工艺单因素试验

2.1.1 料液比的选择

图1 料液比对枣核黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on extraction efficiency of total flavonoids

由图1可知，随着溶剂量的增加，黄酮提取率呈现先升高后降低的趋势。当料液比在1:20～1:50时，提取率随着溶剂量的增大而升高，这是因为提取率的高低与黄酮向溶剂中扩散有关，料液比小，两相界面间的浓度差小，不利于黄酮的扩散。当料液比在1:50～1:70时，提取率反而降低，这可能是由于已浸出的黄酮对未浸出的黄酮的协同浸提作用的影响，料液比大，黄酮质量浓度下降，不利于协同浸提，因而总黄酮提取率反而降低。因此，选定1:30、1:40、1:50、1:60作为正交试验的4个水平。

2.1.2 乙醇体积分数的选择

图2 乙醇体积分数对枣核黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of total flavonoids

由图2可知，随着乙醇体积分数的增大，枣核中总黄酮的提取率先增大后减小。这是因为乙醇对黄酮的溶解度比水大，乙醇对细胞的破坏作用比水强，在微波作用下表现得更加明显。乙醇体积分数在30%～60%之间时，枣核黄酮提取率较高。由此可以看出，乙醇体积分数不宜过高和过低，且乙醇体积分数过高会增加生产成本。因此，选定30%、40%、50%、60%作为正交试验的4个水平。

2.1.3 提取时间的选择

图3 提取时间对枣核黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency of total flavonoids

由图3可知，随着微波作用时间的延长，枣核总黄酮的提取率迅速增大。这是因为微波穿透能力强，微波辐射能导致植物细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热，使细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，使胞外溶剂进入细胞内，溶解并释放出胞内物质。但是，随着提取时间的延长，部分黄酮受热变质，黄酮提取率反而降低。因此，选定15、20、25、30min作为正交试验的4个水平。

图4 微波功率对枣核黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of microwave power on extraction efficiency of total flavonoids

2.1.4 微波功率的选择由图4可知，枣核黄酮的提取率随微波功率的增加而逐渐提高，这是因为随着微波功率的增加，加热速率增大，分子运动速度加快，黄酮类物质的提取率增大。但微波功率大于400W后，枣核总黄酮的提取率随微波功率的增加有所降低。原因可能是：一方面强热效应破坏了溶液中已有的枣核提取物中的黄酮成分；另一方面高温使蛋白质凝固，黄酮成分不易破壁溶出。因此，选定300、400、500、600W作为正交试验的4个水平。

2.1.5 提取温度的选择

图5 提取温度对枣核中黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of total flavonoids

由图5可知，随着微波辐射温度的上升，枣核中黄酮的提取率呈先升降的趋势。分析原因是：从较低温度升至60℃，热效率升高，分子运动加快，利于黄酮的破壁溶出；随着温度的继续升高，一方面已经溶出得黄酮随着热效应加强而变质，另一方面，高温逐渐使部分蛋白凝固不利于黄酮溶出。据此，选定50、60、70、80℃作为正交试验的4个水平。

2.2 枣核总黄酮的微波辅助提取工艺正交试验

根据单因素试验的结果，选取影响枣核总黄酮提取效果各因素中有意义的水平做正交试验，对结果进行极差分析，以确定最佳的提取条件。采用L16(45)正交表以提取时间(A)、微波功率(B)、料液比(C)、乙醇体积分数(D)和提取温度(E)作为5个考察因素，选取4个水平进行正交试验，因素及水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 枣核总黄酮的微波辅助提取工艺优化L16(45)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

表2 枣核总黄酮的微波辅助提取工艺优化L16(45)正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

由表2数据极差分析可知，RC＞RE＞RA＞RD＞RB，各因素对枣核中总黄酮的提取率的影响程度依次为料液比＞提取温度＞提取时间＞乙醇体积分数＞微波功率，料液比对提取的影响最为显著，在试验设计的范围内，优化得到微提取枣核黄酮的最佳条件为A2B3C4D3E2，即提取时间20min、微波功率500W、料液比1:60、乙醇体积分数50%、提取温度60℃。枣核黄酮提取率预测值为0.657%以上。

2.3 最佳工艺条件验证实验

按A2B3C4D3E2条件进行3次平行试验，实测枣核黄酮提取率平均值为0.71%，此工艺条件下枣核黄酮提取率高于表2中任一组试验结果，故A2B3C4D3E2为最优实验条件。

2.4 枣核黄酮提取物粗品的制备

取3份枣核样品各10.0000g，采用上述最佳提取条件进行提取，得黄酮提取液，再按照1.3.2提取工艺，将该溶液进行浓缩精制，得到枣核黄酮粗品，称量计算得平均质量为1.0142g，计算得到黄酮粗品提取产率为10.14%，该枣核黄酮粗品中黄酮含量为7.00%，约为枣核样品中黄酮含量的10倍。

3 结 论

3.1 本实验采用正交试验法优选枣核黄酮的最佳提取工艺条件为料液比1:60、提取温度60℃、提取时间20min、乙醇体积分数50%、微波功率500W，得到枣核黄酮粗品的提取产率为10.14%，粗品中黄酮含量为7.00%。

3.2 实验采用微波提取方法，可以极大地缩短提取时间，且能达到较高的提取效率。因此，微波提取法是一种较为理想的提取方法，具有省时、高效、节能的优点。

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更 正

本刊2012年14期第321～325页刊载的第一作者为徐安书的论文——《茎瘤芥叶胡萝卜混合汁复合乳酸菌发酵饮料的研制》补充基金项目“涪陵榨菜产业发展关键技术集成应用与创新服务体系建设项目(10)”。特此更正！

Optimization of Microwave-assisted Extraction of Total Flavonoids from Chinese Date Seeds

ZHANG Ji-xiang1，OU Lai-li,ang2
(1. Faculty of Chemistry and Material Science, Langfang Teachers College, Langfang 065000, China；
2. Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071, China)

Objective: Orthogonal array design was used to optimize the microwave-assisted extraction of total flavonoids from Chinese date seeds. Methods: Total flavonoids were spectrometrically determined using rutin as a reference compound. The effects of microwave power, extraction time, temperature, solid-to-solvent ratio and ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids were investigated by one-factor-at-a-time experiments. Subsequently, these extraction parameters were optimized by orthogonal array design. Results: Five extraction parameters were ranked in descending order of their effect on the extraction of total flavonoids as follows: solid-to-solvent ratio＞extraction temperature＞extraction time＞ethanol concentration＞microwave power. Their optimal levels were 1:60 (g/mL), 60 ℃, 20 min, 50% and 500 W, respectively. Under these conditions, the extraction yield of crude total flavonoids was 10.14%, and the total flavonoid content of the extract obtained was 7.00%. Conclusion: The extraction efficiency of total flavonoids from Chinese date seeds is remarkably increased by microwave extraction and orthogonal array optimization.

orthogonal array design；microwave extraction；Chinese date seeds；total flavonoids

S511

A

1002-6630(2012)16-0045-05

2011-07-06

河北省教育厅青年基金项目(2010156)

张吉祥(1973—)，男，副教授，博士，研究方向为天然产物中有效成分的提取与分离。E-mail：zhangjixiang1973@163.com