双酶法猪脂氧化改善天然猪肉香精风味的应用

孙 佳，王 超，曹雁平,2,*，王 蓓,2

(1.北京工商大学食品学院，北京 100048；2.食品添加剂与配料北京市高校工程研究中心，北京 100048)

双酶法猪脂氧化改善天然猪肉香精风味的应用

孙 佳1，王 超1，曹雁平1,2,*，王 蓓1,2

(1.北京工商大学食品学院，北京 100048；2.食品添加剂与配料北京市高校工程研究中心，北京 100048)

研究双酶法氧化猪脂在天然猪肉香精中的应用。首先以过氧化值为评价指标，单因素试验和正交试验确定的最佳酶解工艺条件为脂肪酶300μL、脂肪氧合酶400μL、pH8.88。感官评价表明，与使用空气氧化猪脂和未使用氧化猪脂制备的猪肉香精相比，酶法氧化猪脂制备的猪肉香精香味饱满，猪肉特征突出且脂香浓郁。用固相微萃取-气相色谱-质谱法分析比较3种猪脂制备的猪肉香精的挥发性组成，结果表明，3种猪肉香精主体风味成分一致，以2-乙酰呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛、3-甲基噻吩、2-戊基呋喃、2-硫代糠酯等风味成分为主，并且酶氧化猪脂香精含较高比例的2-甲基-呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛。

脂肪酶；脂肪氧合酶；猪肉香精；气相色谱-质谱法

肉味香精是传统食品现代化和餐饮连锁化的重要基础原料，其应用涉及方便食品、肉制品、调味品、膨化食品、速冻食品、焙烤食品、菜肴等领域[1]。中国肉味香精生产始于20世纪80年代，经过约30年的发展已经形成独立的产业。2009年全行业年销售额约100亿元人民币，相关食品工业和餐饮业的产值超过1万亿元人民币[2]。

脂肪氧化产物是肉类特征风味的主要来源[3]。第三代肉味香精[4-6]使用的脂肪氧化产物通常采用空气氧化方式制备，在实验室规模的脂肪调控氧化反应装置是装有机械搅拌和导气管的四口烧瓶[2]；工业化生产规模的设备是气升式内环流反应器[7]。空气氧化的缺点是反应温度高，能耗大。脂肪酶结合脂肪氧合酶氧化法制备氧化脂肪，即脂肪在脂肪酶作用下水解生成脂肪酸和甘油[8]，然后脂肪酸在脂肪氧合酶作用下氧化产生氢过氧化合物，氢过氧化合物通过均裂或β-裂变分解，形成了小分子的醇、醛、酮、酯等多种风味物质和热反应风味前体物质[9-12]，将其作为天然肉味香精的基料，用于制备各种类型的肉味香精。与空气氧化方法相比，酶法氧化方法的原料利用率高、反应条件温和、工艺简单、生产周期短、反应易控制、能耗小，且不会造成环境污染[13-14]。本研究以猪脂为原料，研究猪脂酶法氧化产物对猪肉香精风味的影响，为其工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪脂 台湾正义有限公司；猪里脊肉 市售；脂肪酶(2000U/mL)、风味蛋白酶、复合蛋白酶 Novozymes公司；脂肪氧合酶(1×106U/0.4mL) 美国Sigma公司；KH2PO4、Na2HPO4、碘化钾、可溶性淀粉、硫代硫酸钠(均为分析纯)、葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、VB1、木糖、L-半胱氨酸、水解植物蛋白(HVP) (均为食品级) 国药集团化学试剂有限公司；三氯甲烷、乙酸(均为分析纯) 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

6890N-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器 江苏太仓市实验设备厂；恒温水浴锅 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；78-2磁力搅拌器国华电器有限公司；电磁空气压缩机 浙江森森实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法猪脂氧化单因素试验

固定猪脂8g、pH8.34的磷酸缓冲液2mL、温度45℃、转速110r/min。首先加入100μL脂肪酶，2h后加入脂肪氧合酶100μL，再反应3h。混匀后采用碘量法[15]测其过氧化(peroxide value，PV)值。固定其他条件分别改变：脂肪酶量、脂肪氧合酶量、反应温度、反应pH值、转速、反应时间单一条件，考察其对PV值的影响。

1.3.2 正交试验

选取脂肪酶量、脂肪氧合酶量和缓冲液pH值3个因素，设计L9(33)正交试验优化猪脂氧化条件，试验设计见表1。

表1 双酶法氧化猪脂正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design for optimization of dual-enzymatic oxidation of pork fat

1.3.3 空气氧化猪脂的制备

准确称取8.00g猪脂，加入2mL 1/15mol/L pH8.34的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲液，通入流速为0.16m3/h的压缩空气，在40℃条件下搅拌反应7h。

1.3.4 热反应猪肉香精的制备

将100g 鲜猪里脊肉的肉糜和100g 去离子水加入到500mL烧杯中，95℃水浴保温15min 后冷却至48℃。加入0.6g复合蛋白酶处理0.5h，再加入1.2g 风味蛋白酶处理1h，制成猪肉酶解物。

在装有电动搅拌器、温度计、回流冷凝管的100mL四口烧瓶中加入猪肉酶解物20g、葡萄糖1.2g、甘氨酸0.6g、丙氨酸0.6g、VB10.4g、木糖0.2g、谷氨酸0.3g、L-半胱氨酸1.2g、HVP 2g以及猪脂、空气氧化猪脂或酶法氧化猪脂进行热反应制备猪肉香精[16]，利用感官评价、挥发性成分分析研究不同类型猪脂对猪肉香精风味的影响。

1.3.5 感官评价

将本研究中脂肪酶氧化法制备的猪肉香精(猪肉香精A)、空气氧化法制备的猪肉香精(猪肉香精B)和未氧化猪脂制备的香精(猪肉香精C)按体积分数5%用热水稀释品尝。采用描述评分法进行感官评价[17]，评价标准见表2。

表2 猪肉香精感官评价标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of pork essence

1.3.6 挥发性成分分析

1.3.6.1 固相微萃取

取3mL样品装入萃取玻璃瓶中，放入50℃恒温水浴锅中，平衡40min。平衡完成后用SPME针吸附40min。

1.3.6.2 GC-MS分析

色谱条件：DB-WAX色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；载气为氦气，流速1.2mL/min；升温程序：起始温度40℃，以3℃/min 升温至160℃，再以5℃/min升温至240℃。

质谱条件：70eV，电子电离(electron ionization，EI)，质量扫描范围30～450u，溶剂延迟4.00min。

2 结果与分析

2.1 酶法猪脂氧化与优化

2.1.1 脂肪酶量对猪脂氧化程度的影响

图1 脂肪酶量对PV值的影响Fig.1 Effect of lipase amount on PV value

脂肪在脂肪酶和脂肪氧合酶的共同作用下会生成氢过氧化物，过氧化值是评价油脂氧化程度最基本的指标[18-19]，本研究也采用PV值评价油脂氧化程度。由图1可知，脂肪酶量为300μL时，氧化猪脂的PV值最高，故最佳脂肪酶量为300μL。

2.1.2 脂肪氧合酶量对猪脂氧化程度的影响

图2 脂肪氧合酶量对PV值的影响Fig.2 Effect of lipoxygenase amount on PV value

由图2可知，脂肪氧合酶量为400μL时，氧化猪脂的PV值最高，故最佳脂肪氧合酶量为400μL。

2.1.3 反应温度对猪脂氧化程度的影响

图3 反应温度对PV值的影响Fig.3 Effect of reaction temperature on PV value

由图3可知，在35～40℃范围内，随着温度的升高，猪脂的PV值增大；40～55℃范围内，温度升高时猪脂的PV值逐渐减小，说明过高的温度抑制了酶的活力。其中40℃时其PV值最高，因此反应的最适温度为40℃。

2.1.4 pH值对猪脂氧化程度的影响

图4 pH值对PV值的影响Fig.4 Effect of pH on PV value

由图4可知，在pH7.50～8.88的范围内，猪脂PV值先增大后减小，其中pH8.34时氧化产物PV值最大，故最佳pH值为8.34。

2.1.5 搅拌转速对猪脂氧化程度的影响

图5 搅拌转速对PV值的影响Fig. 5 Effect of rotation speed on PV value

由图5可见，转速为110r/min时氧化产物的PV值最大，因此最适转速为110r/min。

2.1.6 反应时间对猪脂氧化程度的影响

图6 反应时间对PV值的影响Fig.6 Effect of reaction time on PV value

从图6可以看出，PV值随反应时间的延长而增大，7h后趋于平缓，故7h为最佳反应时间。

2.1.7 酶法猪脂氧化条件优化

正交试验结果见表3，方差分析见表4。各因素对猪脂氧化状态的影响趋势见图7。

表3 酶法猪脂氧化正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal array design and corresponding results for optimization of dual-enzymatic oxidation of pork fat

由表4极差R可以看出，在正交试验所选择的因素、水平范围内，脂肪氧合酶量是最重要的影响因素，脂肪酶量次之，pH值影响最小。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis for PV value with various reaction conditions

图7 各因素对猪脂氧化状态的影响趋势Fig.7 Effects of three factors at three different levels on PV value

由图7可以看出：脂肪酶量300μL、脂肪氧合酶量400μL、pH8.88时，PV值最高，而在其他水平上的PV值相对较小。因此，正交试验获得的猪脂氧化最优组合为A2B2C3，即脂肪酶量300μL、脂肪氧合酶量400μL、pH8.88。

2.2 感官评价

评价员对3种猪肉香精各项指标评分后统一求和，计算各香精样品的分项得分和综合得分。3种猪肉香精的分项感官描述得分见图8。

图8 3种猪肉香精各项指标平均得分比较Fig.8 Comparison of average score for each index in three pork essences

由表5以及图8可知，在各项指标的感官评价中，本研究酶氧化法制备的猪肉香精(猪肉香精A)质量最优，而且各项指标均处于较高水平，且脂香浓郁；空气氧化法制备的猪肉香精(猪肉香精B) 次之，其脂香不够突出，导致其特征香气不够饱满；未氧化猪脂制备的香精(猪肉香精C)气味最差，各项指标得分均较低，尤其缺少氧化脂肪所产生的香气，导致其整体香气水平较低。

2.3 GC-MS分析

对酶氧化、空气氧化和未氧化猪脂热反应制得的香精进行GC-MS分析，得到总离子流色谱图(图9)，鉴定出的主要香味成分(相对含量＞0.4%)及其相对含量见表5～7。

图9 猪肉香精的总离子流色谱图Fig.9 Total ion current chromatograms of three pork essence

GC-MS分析结果显示，3种猪肉香精含量较高的风味物质都为2-乙酰呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛、2-甲基呋喃、3-甲基噻吩、2-戊基呋喃、2-硫代糠酯等。其中，2-戊基呋喃是猪肉香精中对整体香味作出重要贡献的关键芳香活性化合物[20-21]。

3种猪肉香精含量较高的风味物质都为2-乙酰呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛、2-甲基呋喃、3-甲基噻吩、2-戊基呋喃、2-硫代糠酯等。其中，呋喃类的含量最高，尤其是含有对猪肉风味做出贡献的关键芳香活性化合物2-戊基-呋喃[22-23]，因此3种香精都有浓郁的炖猪肉的香味。

酶法氧化猪脂制备的猪肉香精中，木糖为羰基化合物，HVP提供氨基化合物，高含量(25.6%)的乙酸提供了合适的pH值环境，因此酶法制备的香精中含有1,3-二嗪和二氢-2-甲基-3(2H)呋喃酮，使得酶法制备的猪肉香精在炖肉味的基础上，还有烤香味[24]。与未氧化猪脂制备的猪肉香精对比，氧化猪脂的加入，对美拉德反应产生了抑制作用，造成含硫化合物的含量降低，而酶法制备香精中含硫化合物的比例远少于空气法制备的香精，这会导致热反应产物的刺鼻硫化物气味变得柔和，出现协调的肉香味及猪肉的特征风味[25]。其中，未氧化猪脂制备的猪肉香精中含有较高比例的3-甲基-噻吩、2-硫代糠酯，还含有空气法和酶法没有的吡嗪、2-乙酰吡咯和5-甲硫基四氮唑等；空气氧化猪脂制备的猪肉香精含有较高比例的噻吩并[3,2-b]噻吩，含有其他方法没有的1,2-苯并异噻唑和2-乙酰吡咯等，不含3-糠醛；酶氧化猪脂制备的猪肉香精中含有较高比例的2-甲基呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛，含有较多的3-糠醛[12]、2-丁酮、2-亚丙烯环丁烯、2-(3-羟丙基)-2-吡咯烷酮等。

表5 GC-MS分析未氧化猪脂制备的猪肉香精挥发性风味成分Table 5 GC-MS analysis of flavor components in pork essence prepared with non-oxidized pork fat

表6 GC-MS分析空气氧化猪脂制备的猪肉香精挥发性风味成分Table 6 GC-MS analysis of flavor components in pork essence prepared with air-oxidized pork fat

表7 GC-MS分析酶氧化猪脂制备的猪肉香精挥发性风味成分Table 7 GC-MS analysis of flavor components in pork essence prepared with enzymatically oxidized fat

3 结 论

实验确定的酶法猪脂氧化最佳工艺条件为温度40℃，反应时间7h。正交试验最佳组合为脂肪酶量为300μL、脂肪氧合酶量为400μL、pH8.88。感官评价表明，与空气氧化法和未氧化法制备的香精相比，酶解脂肪猪肉香精香味饱满，猪肉特征突出且脂香浓郁。GC-MS分析结果显示，3种猪肉香精主体风味成分一致，酶氧化猪脂香精含较高比例的2-甲基呋喃、5-甲基-2-噻吩甲醛等。

酶法氧化猪脂制备的天然肉味香精含有的较高的醛类使其猪肉特征风味饱满，但是含有2-戊基呋喃的比例较低，其炖肉味相比未氧化法和空气法制备的香精较淡。因此，有必要进一步研究确定其他成分对天然猪肉香精风味的影响，以及氧化猪脂中各成分形成天然猪肉香精风味成分的机制和途径。

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Application of Pork Fat Oxidized by Dual Enzyme Method for Improving the Flavor of Natural Pork Essence

SUN Jia1，WANG Chao1，CAO Yan-ping1,2,*，WANG Bei1,2
(1. College of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing 100048, China)

The application of pork fat oxidized by dual enzyme method for improving the flavor of natural pork essence was explored in this work. The optimal enzymatic reaction conditions for preparing oxidized pork fat, as determined using onefactor-at-a-time and orthogonal array design methods based on peroxide value (PV), were 300 μL of lipase, 400 μL of lipoxygenase and pH 8.88. Sensory evaluation revealed that pork essence based on oxidized pork fat obtained from enzymatic oxidation had a full aroma and outstanding characteristic flavor of porcine fat as compared with pork essences prepared from air-oxidized or non-oxidized pork fat. The results of solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry (SPME/ GC-MS) analysis indicated that these three pork essences had the same major flavor components, which included 1-(2-furanyl)-ethanone, 5-methyl-2-thiophenecarboxaldehyde, 3-methyl-thiophene, 2-pentyl-furan and 2-furfurylthiol. Moreover, pork essence based on enzymatically oxidized fat was richer in 2-methyl-furan and 5-methyl-2-thiophene formaldehyde.

lipase；lipoxygenase；pork flavor；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS264.3

A

1002-6630(2012)16-0084-07

2012-04-02

孙佳(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：jiaer0620@163.com

*通信作者：曹雁平(1961—)，男，教授，博士，研究方向为食品化学与安全。E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn