顶空-固相微萃取-气相色谱串联质谱法测定葡萄酒中多种氯酚及氯代茴香醚

陈树兵，孟 原，施 瑛，倪梅林，莫燕霞，贺小雨

(1.宁波出入境检验检疫局技术中心，浙江 宁波 315012；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；3.南京农业大学理学院，江苏 南京 225001)

顶空-固相微萃取-气相色谱串联质谱法测定葡萄酒中多种氯酚及氯代茴香醚

陈树兵1，孟 原2，施 瑛3，倪梅林1，莫燕霞1，贺小雨1

(1.宁波出入境检验检疫局技术中心，浙江 宁波 315012；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；3.南京农业大学理学院，江苏 南京 225001)

样品中氯酚经乙酰化生成乙酰氯酚后，通过优化萃取头、离子强度、温度、时间等固相微萃取条件后，建立顶空-固相微萃取-气相色谱串联质谱法同时测定测定葡萄酒中的3种氯酚2,4,6-三氯酚(TCP)、2,3,4,6-四氯酚(TeCP)、五氯酚(PCP)以及两种氯代茴香醚2,4,6-三氯苯甲醚(TCA)、五氯苯甲醚(PCA)含量的方法。结果表明：该方法检出限为0.1ng/L，回收率为86.0%～105.9%，相对标准偏差小于16.5%。该方法前处理简单、高效、检测灵敏度高，可应用于进出口葡萄酒中木塞污染物的监控。

氯代茴香醚；氯酚；顶空-固相微萃取；气相色谱串联质谱；葡萄酒

葡萄酒在酿制、存放过程中出现霉味、泥土味主要是由于酒中含有2,4,6-三氯苯甲醚(TCA)、2,3,4,6-四氯苯甲醚(TeCA)、五氯苯甲醚(PCA)等被称作木塞污染物的氯代茴香醚类化合物[1-3]，其中以TCA在酒中的嗅觉阈值最低，有报道称葡萄酒中TCA含量达到10ng/L就会影响到风味和品质，因而对酒的品质影响最大。目前，已有相关文献报道通过液液萃取、固相萃取、固相微萃取等的前处理后，采用气相色谱、气相色谱-离子阱质谱联用仪等测定葡萄酒的TCA等氯代茴香醚[4-8]。另外，有研究表明葡萄酒生产过程中可能迁移进入酒中或木塞中的一些氯酚如2,4,6-三氯酚(TCP)、2,3,4,6-四氯酚(TeCP)以及五氯酚(PCP)等在葡萄酒的存放过程中由于普通微生物的作用也可以转化为氯代茴香醚类化合物[9-10]，从而影响葡萄酒品质。因此，在分析葡萄酒中木塞污染物时，除了应考虑检测直接对酒类风味产生影响的氯代茴香醚类物质，也应该检测可以转化为木塞污染物的氯酚类物质。

顶空进样法是目前测定挥发性化合物的常用手段，而顶空-固相微萃取法前处理具有前处理方法简单，操作简便，灵敏度高等特点[11-12]。由于氯酚类物质极性较强，不易从酒中挥发，因此本研究通过在线衍生乙酰化氯酚后[13-14]，建立顶空固相微萃取-气相色谱串联质谱(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-tandem quadrupole mass sectrometry，HS-SPMEGC/MS/MS)同时测定葡萄酒中痕量氯酚及氯苯甲醚的分析方法，并应用该方法检测部分进口葡萄酒样品，旨在为进出口葡萄酒中氯代茴香醚及氯酚含量的监控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

葡萄酒 进口。

2,4,6-三氯苯甲醚(TCA，纯度不低于99%)、五氯苯甲醚(PCA，纯度不低于99%)、2,4,6-三氯酚(TCP，纯度不低于99%)、2,3,4,6-四氯酚(TeCP，纯度不低于99%)、五氯酚(PCP，纯度不低于99%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸酐(分析纯) 美国Sigma公司；无水K2CO3、氯化钠(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；甲醇(分析纯) 美国Dima公司；萃取头PDMS(100μm) 美国Supelco公司。

7000B气相色谱-串联质谱(配备电子电离源)、HP-5色谱柱(30.0m×0.25mm，0.25μm) 美国Agilent公司。

1.2 溶液的配制

标准储备液的配制：精确称取TCP、TeCP、PCP以及TCA、PCA各10mg溶于10mL甲醇中，配制成质量浓度为1mg/mL的标准溶液。准确吸取上述各标准储备液1mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，配制成10μg/mL的混合标准溶液，摇匀置于4℃冰箱储存备用。

5g/100mL K2CO3溶液：准确称取12.5g无水碳酸钾置于烧杯中，加水搅拌溶解后转移到容量瓶(250mL)中，定容至250mL。

1.3 色谱和质谱条件

色谱条件：HP-5色谱柱(30.0m×0.25mm，0.25μm)；初始柱温50℃保持1min，以20℃/min升至115℃，然后以5℃/min升至200℃，再以30℃/min升至250℃。载气为He气，恒流模式，流速1.2mL/min，气化室温度250℃，不分流进样。

质谱条件：电子电离源(electron ionization，EI)模式、离子源温度300℃、电子能量70eV、传输线温度250℃、溶剂延迟时间4.5min。5种目标化合物的测定参数如表1所示。

表1 乙酰化氯酚和氯苯甲醚保留时间及MS/MS条件参数Table 1 Retention time and MS-MS detection parameters for acetylchlorophenols and chloroanisols

1.4 固相微萃取条件

准确移取5mL酒样于15mL顶空进样瓶中，加入3g NaCl、2mL 5g/100mL K2CO3溶液、200μL乙酸酐，用带隔垫的铝盖封口，振荡1min之后，静置衍生20min。预平衡温度和萃取温度为70℃，预平衡时间15min、萃取时间20min、恒温振荡槽中预平衡时振动速率150r/min、萃取时振动速率150r/min。完成萃取过程后，本实验采用手动进样，减少萃取装置在空中的暴露时间，迅速进样，热脱附时间为5min。

2 结果与分析

目前，氯代茴香醚类物质已有文献报道采用固相微萃取技术作为前处理手段吸附、富集并结合气相色谱、气相色谱-质谱联用仪进行分析[4-8]，而氯酚类物质极性较强，挥发性差，不能直接采用气相色谱进行分析，因此本研究采用分析酚类物质时常用的乙酰化衍生法[14-16]，在酒样中直接加入乙酸酐作为乙酰化衍生试剂，在碱性条件下生成乙酰氯酚类物质，并讨论了萃取头类型、样品溶液的离子强度、萃取温度、萃取时间等影响乙酰氯酚及氯代茴香醚萃取效率的主要因素。

2.1 萃取头的选择

萃取头的选择主要要考虑两点，一方面是根据待分析物的极性。萃取头的固定相涂层有极性涂层，如聚丙烯酸酯(PA)、聚乙二醇(CW)，适于极性化合物；非极性涂层，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，适于非极性和弱极性化合物；中等极性混合型涂层，包括聚乙二醇聚二乙烯基苯(CW-DVB)、羧乙基-聚二乙烯基苯(CARDVB)、羧乙基-聚二乙烯基苯-聚二甲基硅氧烷(CARDVB-PDMS)等；另一方面是涂层厚度对分析物的固相吸附量和平衡时间都有影响，涂层越厚，固相吸附量越大，灵敏度亦越高；但涂层越厚，达到分析平均的时间越长，解析平衡时间也越长，分析速度慢，因此应综合以上因素选择合适的涂层厚度。总的看来，涂层厚度对分析灵敏度影响较大，对分析速度影响较小。通过比较聚二甲基硅氧烷(PDMS，100μm)，聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm)，聚丙烯酸酯(PA，85μm)，聚二甲基硅氧烷-羧乙基(PDMSCAR，75μm)及二乙烯基苯-羧乙基-聚二甲基硅氧烷(DVB-CAR-PDMS，50/30μm)的顶空萃取效果后，发现100μm PDMS萃取头的萃取效果最好。

2.2 离子强度的影响

图1 离子强度对各分析物(200μg/L)响应值的影响Fig.1 Effect of ionic strength on response value of analytes

适当增加溶液中的离子浓度可以减少被分析物在溶液中的可溶性，能使更多的挥发性物质挥发至溶液的顶空，吸附到纤维头，从而降低方法的检测限。离子强度的影响通过加入NaCl的量进行研究。NaCl的加入提高了分析物的气液分配系数，这样可以使分析物的溶解性下降，提高萃取效率。实验研究加入0.5～4g NaCl后的萃取效果，如图1所示，当NaCl加入3g时各种分析物均达到较好的萃取效果。

2.3 萃取温度的影响

图2 萃取温度对于各分析物(50ng/L)响应值的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on response values of five analytes

由图2可见，分析物回收率受温度选择的影响，响应值有所波动，温度上升对于TCA的萃取影响较小，而对于其他4种分析物，温度升高萃取效果显著，温度上升70℃可以让各萃取物达到最佳效果，温度高于70℃萃取量的趋于稳定或者有所下降。因此，70℃被确定为最佳萃取温度。

2.4 萃取时间的影响

图4 萃取时间对各分析物(50ng/L)响应值的影响Table 4 Effect of extraction time on response values of five analytes

由图4可见，从各分析物萃取时间来看，在10～20min萃取效果呈递增趋势，而到20min之后趋于平缓。因此，20min的萃取时间选择为最佳萃取时间。

2.5 标准曲线及方法的检出限

以新开的葡萄酒为样品，分别添加2,4,6-三氯酚(TCP)、2,3,4,6-四氯酚(TeCP)、五氯酚(PCP)以及2,4,6-三氯苯甲醚(TCA)、五氯苯甲醚(PCA)1μg/L的混合标准溶液20、50、100、250、500μL，按照1.4节条件萃取并进样分析，以样品峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，并确定检出限(RSN＝3)见表2。

表2 木塞污染物的线性方程及检测限Table 2 Linear equations and detection limits for cork pollutants

2.6 样品回收率与精密度测定

表3 葡萄酒样品中木塞污染物的加标分析(n=5)Table 3 Recovery rates and RSDs for cork pollutants in spiked wine

选取阴性葡萄酒样品，分别添加了10、20、50ng/L 3个添加量的5种木塞污染物，考察了回收率及精密度。如表3所示，5种木塞污染物的回收率86.0%～105.9%，相对标准偏差小于16.5%。结果表明，本研究建立的顶空固相微萃取-气相色谱串联质谱检测方法具有较高的准确性，可以满足葡萄酒样品中木塞污染物的监控要求。加标样品的MRM模式质谱图见图5。

图5 样品加标MRM模式总离子流图(100ng/L)Fig.5 Total ion current chromatogram of spiked positive sample

2.7 实际葡萄酒样品检测

采用该检测方法对不同类型的进口葡萄酒(干红、干白、起泡酒、发酵酒和甜红等)共计84个样品进行检测，其中TCA检出率为15.5%，但含量均低于嗅觉阈值10ng/L；TCP检出率为100%，含量在2.13～369.43ng/L之间；TeCP检出率为83.3%，检测出的最高含量为21.44ng/L；PCA的检出率为33.3%，但含量均很低，远低于其在水中的嗅觉阈值4000ng/L[9]；PCP的检出率为33.3%，最高检出量为32.12ng/L。

3 结 论

本研究通过在线衍生氯酚后，采用顶空-固相微萃取-气相色谱串联质谱法检测了葡萄酒中多种氯酚、氯苯甲醚等木塞污染物。对100μm PDMS萃取头的萃取条件进行优化：5mL酒样中加入200μL乙酸酐常温衍生20min，加入3g NaCl，在振荡萃取条件下，萃取时间20min、萃取温度70℃，方法灵敏度高，回收率为86.0%～105.9%，RSD小于16.5%，建立的木塞污染物检测方法可以满足日常进出口葡萄酒中氯酚、氯苯甲醚等木塞污染物的监控要求。

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Determination of Chlorophenols and Chloroanisols in Wine by Headspace Solid-Phase Microextraction and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Shu-bing1，MENG Yuan2，SHI Ying3，NI Mei-lin1，MO Yan-xia1，HE Xiao-yu1
(1. Technology Center, Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo 315012, China；2. Faculty of Maritime,Ningbo University, Ningbo 315211, China；3. College of Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 225001, China)

A headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometric (HS-SPME- GCMS/MS) method was proposed for the simultaneous determination of three chlorophenols 2,4,6-trichlorophenol (TCP), 2,3,4,6-tetrachlorophenol (TeCP), pentachlorophenol (PCP) and two chloroanisols including pentachloroanisol (PCA) and 2,4,6-trichloroanisol (TCA) in wine. Chlorophenols from wine samples were acetylated and then analyzed by GC-MS/MS in a multireaction monitoring (MRM) mode. Four extraction parameters including extraction fiber, ion strength, extraction temperature and extraction time were optimized. The results showed that the limit of detection of this method was 0.1 ng/L. The average spike recovery rates of five analytes in a positive sample were 86.0%－105.9% with a RSD less than 16.5% (n= 5). This method was simple, effective, sensitive and therefore applicable to monitor cork taint in exported and imported wine.

chlorophenols；chloroanisols；HS-SPME；GC-MS/MS；wine

TS207.3；O657

A

1002-6630(2012)16-0146-04

2011-10-12

项目支持：国家质检总局科技计划项目(2009IK172)

陈树兵(1980—)，男，工程师，硕士，研究方向食品安全与食品污染物分析。E-mail：chensb@nbciq.gov.cn