美拉德反应产物的褐变、荧光吸收及抗氧化性的研究

张 严，汪何雅，*，钱 和

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122; 2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

美拉德反应产物的褐变、荧光吸收及抗氧化性的研究

张 严1，汪何雅1，*，钱 和2，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122; 2.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

采用以还原糖－氨基酸（木糖/葡萄糖分别与甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸）模式美拉德反应（Maillard Reaction，MR）制备得到美拉德反应产物（MRPs），研究反应条件对MRPs的褐变程度、荧光吸收强度以及其抗氧化活性的影响，并分析MRPs的光学特征与抗氧化活性之间的联系。结果表明，还原糖和氨基酸的种类对MR的褐变强度有很大影响，其影响程度由强到弱分别为:Xly＞Glc，Lys＞Gly＞Glu＞Cys。随着反应时间的延长，各体系MRPs的褐变程度逐渐变强;而荧光吸收强度随着加热时间的延长而增强，然后在出现最大值后趋于平缓或者表现出下降的趋势。MRPs的抗氧化能力也随反应时间的延长而增强，抗氧化活性与褐变强度呈正相关，与荧光吸收特性没有表现出明显的关联。

美拉德反应产物，褐变，荧光吸收，抗氧化活性

美拉德反应（Maillard Reaction，MR）是羰基化合物（尤其是还原糖）与氨基化合物（氨基酸、肽类、蛋白质等）发生的一系列复杂的非酶促褐变反应，也被称为羰氨反应。热反应和长时间的储藏都会促使美拉德反应的发生，其特殊的色泽和风味意义使得它在食品生产中得到广泛的应用［1］。褐变是MR最显著的特征，早期对MR的研究主要是在色度和吸光度方面，用360～490nm区间的特征吸收峰表征类黑素物质产生的速率和积累程度。随着对MR研究的深入，1942年Pearce和Thistle首先发现MRPs具有一定的荧光吸收特性，并用以表征食品储存期间的变质［2］。目前，对于MRPs中呈现褐色或荧光吸收特性的具体物质，除了少数结构被揭示外，大量仍未知。一些研究指出MR中荧光吸收现象先于褐变，所以，一般认为荧光吸收物质是大分子褐色物质的前体物［3］。色素物质、荧光吸收物质的产生需要一个诱导期，而荧光物质所需要的诱导时间较短。一般将荧光物质作为美拉德反应的指示剂，其可以灵敏地反映美拉德反应的早期过程［4］。大量研究发现，美拉德反应产物具有较强的抗氧化活性。然而，由于MRPs的复杂性和不稳定性，人们尚不完全清楚美拉德反应产物中具有抗氧化活性的是何物质。一些针对不同食品体系中MRPs的抗氧化活性与其光学特征之间的相关性研究，也一直存在着争议。一些实验表明，葡萄糖与赖氨酸、甘氨酸的模式美拉德反应产物的抗氧化活性与颜色呈现一定的线性相关性（与褐变颜色成正比），并指出这是因为反应产生类黑精的缘故［5－9］。但也有学者在对MRPs清除DPPH自由基的研究中发现，褐变与清除效果没有关系，但荧光吸收特性与清除活性有关，认为荧光吸收可以表征清除自由基能力［10］。本工作沿用还原糖－氨基酸的模式美拉德反应，测定不同美拉德反应条件（还原糖和氨基酸种类，反应时间）对产物褐变程度、荧光吸收强度以及抗氧化活性的影响，并分析其褐变、荧光吸收与抗氧化活性之间的关联。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘氨酸（Gly）、葡萄糖（D－Glc）、盐酸、三氯乙酸、维生素C（VC）、石油醚、二甲基硅油 分析纯，国药集团化学试剂公司;L－赖氨酸（L－Lys）、半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Glu）、木糖（D－Xyl） 生化试剂，纯度大于98%，国药集团化学试剂公司;偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH） sigma公司。

PB303－N电子天平、Delta 320pH计 Mettler－Toledo Group公司;HH－2数显恒温水浴锅 江苏荣华仪器制造有限公司;TU－1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;R－501旋转蒸发仪 上海申顺生物科技有限公司; KH－500B超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪表制造有限公司;Centrifuge 5804r/min台式高速离心机 德国Eppendorf公司;F－7000日立荧光分光光度计 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 美拉德反应产物的制备 用磷酸缓冲液（pH 7.0）将各氨基酸（甘氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺）与还原糖（葡萄糖，木糖）按物质的量比1∶1配成反应混合液（0.4mol/L:0.4mol/L），用 6mol/L NaOH与6mol/L HCl调节pH为7.0，制备得Glc－Gly、Glc－Lys、Glc－Glu、Glc－Cys;Xyl－Gly、Xyl－Lys、Xyl－Glu、Xyl－Cys共8种模式美拉德反应体系。将各体系置于100℃油浴中加热回流处理，在不同的时间（0、15、30、60、90、120、180、240m in）分别进行取样测定。

1.2.2 美拉德反应产物褐变程度的测定 将MRPs用蒸馏水稀释50倍，采用可见分光光度计在420nm处测定吸光度［10－11］。

1.2.3 美拉德反应产物荧光吸收强度的测定 用m ili－Q水稀释MRPs（1/50，v/v），以防止荧光的猝灭效应。稀释的溶液在激发波长（λEx）347nm，发射波长（λEm）415nm下测定荧光吸收强度［12－13］。

1.2.4 美拉德反应产物抗氧化活性的测定

1.2.4.1 大豆卵磷脂脂质体的制备［14］将一定量的大豆卵磷脂溶解于石油醚（30～60℃）中，用真空旋转蒸发仪（35 r/m in，40℃）去除有机溶剂，得到分散的卵磷脂薄膜，取下后立即用氮气吹干。向卵磷脂薄膜中加入10mmol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液，超声处理得到白色乳状的脂质体溶液（LPS）。

TCA－TBA－HCl溶液的配制:将15g三氯乙酸（TCA）、3.7g硫代巴比妥（TBA）、2.1m L盐酸（HCl）依次加入100m L水中，充分混合。

1.2.4.2 MRPs对AAPH诱导卵磷脂脂质体氧化水平的影响 在实验之前首先确定AAPH诱导氧化的最佳反应条件（LPS浓度、AAPH浓度、反应时间），然后再在该最佳条件下测定样品对AAPH诱导卵磷脂脂质体氧化水平的影响。

AAPH诱导氧化的最佳反应条件的确定:在试管中依次加入1m L一定浓度的LPS，2m L一定浓度的AAPH溶液，摇匀，37℃水浴避光放置不同时间，取出冷却后加入TCA－TBA－HCl溶液2m L，混匀后沸水加热15m in，迅速冷却，5500 r/m in离心20m in，取上清液于532nm测定得到吸光度A［15］。通过硫代巴比妥反应物质（TBARS）在532nm的摩尔吸收系数1.56×105L·mol－1·cm－1，由比尔定律 A= εbc计算TBARS含量。通过LPS浓度、AAPH浓度以及反应时间对TBARS影响的曲线，确定最佳反应条件。

在确定的最佳反应条件下，在试管中依次加入1m L的LPS、2m L的AAPH和1m L样品，摇匀，37℃水浴避光放置确定好的时间，取出冷却后加入TCATBA－HCl溶液2m L，混匀后沸水加热15m in，迅速冷却，5500 r/m in离心20m in，取上清液置于532nm处测得吸光度As。对照组以蒸馏水代替样品，测得吸光度Ac。另外，由于样品的颜色对TBARS吸光度的测定有较大的影响，所以还要扣除样品自身在532nm处的吸光度。在实验的同时，用蒸馏水代替除样品外所加入的其他试剂，并作同样的处理，在532nm处测得吸光度值为A样品。样品对脂质体氧化的抑制率的计算公式为:

1.2.4.3 MRPs对Fe3+/VC诱导卵磷脂脂质体氧化水平的影响 在试管中依次加入1m L 10mg/m L LPS，1m L 400μmol/L的FeCl3、1m L 400μmol/L的VC以及1m L的样品，振荡摇匀［16］。37℃水浴避光放置1h，其余操作及对照组等其他的实验及抑制率的计算方法同1.2.4.2。

2 结果与讨论

2.1 不同体系MRPs的褐变程度

MRPs经稀释后在420nm处测得的吸光度随反应时间的变化规律见图1。由图1可以看出，随着反应时间的延长，MRPs的褐变程度逐渐增强。并且，在反应前30m in，木糖－赖氨酸反应产生褐变物质的速率最快，30m in后逐渐趋于平缓。葡萄糖－赖氨酸在反应初期的褐变程度低于木糖－赖氨酸，但后期（60m in后）褐变程度在所有体系中最强。赖氨酸是四种氨基酸中发生美拉德反应最强烈的一种，这可能是由于赖氨酸含有两个氨基，它与还原糖具有更快的MR反应速度。从图1中还可以看出，葡萄糖－半胱氨酸反应产生褐变程度最弱，几乎不产生褐色素。

总体来说，木糖比葡萄糖更容易发生MR，产生褐色素;氨基酸种类对美拉德反应具有很大影响，其对褐变程度的影响由强到弱为赖氨酸＞甘氨酸＞谷氨酸＞半胱氨酸。

图1 MRPs的褐变程度随反应时间的变化规律Fig.1 The browning trends of MRPs derived with different heating time

2.2 不同体系MRPs的荧光吸收强度

图2显示了不同体系中MRPs的荧光吸收强度随反应时间变化的规律。由图2可以看出，与各体系的褐变物质产生规律不同，大多体系（除葡萄糖/木糖－半胱氨酸体系和葡萄糖－谷氨酸外）中荧光吸收物质在很短的时间内达到最大值，然后随着反应的延长而降低。这说明在MR过程中，荧光吸收物质在反应的前期形成，随着反应进程的推进，它们进一步参与反应，形成大分子的MRPs，并部分失去具有荧光吸收的结构。

图2 MRPs的荧光吸收强度随反应时间的变化规律Fig.2 The fluorescence intensity of MRPs derived with different heating time

2.3 MRPs抗氧化性的测定结果

2.3.1 AAPH诱导脂质体氧化的最佳反应条件的确定 通过单因素实验，得出LPS浓度、AAPH浓度和反应时间对AAPH诱导的脂质体氧化程度的影响，分别见图3～图5。由图3～图5可见，AAPH诱导脂质体氧化的最佳反应条件为10mg/m L LPS、8mmol/L的AAPH溶液、反应60m in。

2.3.2 MRPs对AAPH诱导和Fe3+/VC诱导脂质体氧化水平的影响 在2.3.1的条件下，测定的各体系MRPs对AAPH和Fe3+/VC诱导脂质体氧化水平的影响见图6。由图6可以看出，绝大部分还原糖－氨基酸反应产生的MRPs都具有一定的抗氧化活性，并且随着美拉德反应时间的延长，MRPs的抗氧化能力增强。其中还原糖－赖氨酸反应产物对 AAPH和Fe3+/VC诱导脂质体氧化都具有最强的抑制活性;而还原糖－半胱氨酸反应产物的抗氧化性最弱，甚至在反应的开始阶段它们还表现出很强的促氧化性。在葡萄糖－氨基酸和木糖－氨基酸反应体系中，不同氨基酸产生的MRPs的抗氧化活性由强到弱均为Lys＞Gly＞Glu＞Cys;在葡萄糖、木糖与同种氨基酸反应体系中，两种还原糖产生的MRPs的抗氧化活性由强到弱为X ly＞Glc。MRPs的抗氧化活性与其褐变程度相同。

因此，从以上结果可以推测，模式美拉德反应体系中，MRPs的抗氧化活性主要来源于那些具有褐色的类黑精，但其他一些非色素成分也可能会发挥一部分作用。

图3 LPS浓度对TBARS含量的影响Fig.3 The influence of LPS concentration on TBARS （反应1h，AAPH的浓度为5mmol/L）

图4 AAPH浓度对TBARS含量的影响Fig.4 The influence of AAPH concentration on TBARS （LPS浓度为10mg/mL，反应1h）

图5 反应时间对TBARS含量的影响Fig.5 The influence of reaction time on TBARS （LPS浓度为10mg/mL，AAPH的浓度为8mmol/L）

图6 MRPs对卵磷脂脂质体的抗氧化活性Fig.6 The antioxidantion activity of MRPs in LPS

3 结论

随着反应时间的延长，各美拉德反应体系的褐变程度逐渐变强;考察了不同还原糖、氨基酸对其反应产物褐变程度的影响，发现其规律为:Xly＞Glc，Lys＞Gly＞Glu＞Cys。MR过程中，荧光吸收物质更倾向于在反应早期阶段产生，MRPs的荧光吸收强度在短时间内达到最大值，随后缓慢降低。

绝大部分还原糖－氨基酸反应产生的MRPs都具有一定的抗氧化活性，并且随着美拉德反应时间的延长，MRPs的抗氧化能力增强，这与其褐变的变化规律一致。其中还原糖－赖氨酸反应产物具有最强的抑制活性。在葡萄糖/木糖－氨基酸反应体系中，不同氨基酸产生的 MRPs的抗氧化活性由强到弱均为 Lys＞Gly＞Glu＞Cys。因此，美拉德反应产物的抗氧化活性与其褐变程度具有较强的相关性。

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Research of the browning，fluorescence characteristics and antioxidant activity of the Maillard reaction products

ZHANG Yan1，WANG He－ya1，*，QIAN He2，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China; 2.State Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The Maillard reaction p roducts（MRPs）were p repared by using xylose（pentose），g lucose（hexose）and d ifferent am ino acids（g lycine，lyscine，g lutam ine，cysteine）by model Maillard reac tion.The influence of reaction conditions on browning，fluorescence charac teristics and antioxidant ac tivity was surveyed.Then the connec tion of the three aspects were analyzed.The results indicated that the sugars and am ino acids had different reaction power:Xly＞G lc，Lys＞G ly＞Glu＞Cys.The browning of every systems increased and the fluorescence intensity had a maximum value and then becam e sm ooth or dec reased.The antioxidant capacity was p roportional to b rowning，but d id not show significant association w ith the fluorescence intensity changes.

Maillard reac tion p roduc ts（MRPs）;b rowning;fluorescence;antioxidant ac tivity

TS201.2

A

1002－0306（2012）06－0193－04

2011－06－09 *通讯联系人

张严（1985－），男，硕士研究生，研究方向:食品加工与安全质量控制。