三氯乙酸沉淀罗非鱼肉蛋白酶解液的液相色谱分析

韩道财，杨 萍，洪鹏志

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088）

三氯乙酸沉淀罗非鱼肉蛋白酶解液的液相色谱分析

韩道财，杨 萍*，洪鹏志

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088）

用不同浓度三氯乙酸（TCA）溶液沉淀罗非鱼肉Alcalase 2.4L酶解液，采用高效体积排阻色谱法对酶解液及沉淀后所得上清液的分子量分布进行分析，研究TCA对酶解液中蛋白或肽的沉淀效果。结果表明，1、2、5h酶解液的不同分子量肽段在1%、3%、5%、7%、10%TCA中都有沉淀作用，大于9.5ku组分的沉淀百分比在47.86%～59.28%之间，2.5～1.4ku的在38.41%～65.49%之间，1.0ku的在21.32%～78.89%之间。随TCA浓度的增加，沉淀百分比增加或减少。

三氯乙酸，沉淀，酶解液，肽

在生物化学、食品科学及其他研究领域中，人们经常用到蛋白或多肽的沉淀剂，其中三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）应用最为广泛。科学研究中，不同浓度的TCA经常被用来从蛋白中分离出肽，并且一般认为TCA浓度越高，能够溶解在TCA溶液中的肽的量就越少。三氯乙酸对蛋白的沉淀主要归功于三个氯原子的独特作用[1]。有报道[2]认为，当多肽的氨基酸残基数为10时，在质量分数为13.6%的TCA溶液中溶解度大约为40%。Greenberg[3]等认为，在10%的TCA溶液中能够溶解的肽段的平均分子量在330～380u之间。多年来，利用酶工程技术制备生物活性肽的研究越来越多[4－6]，其中，肽含量的测定是一个必需的手段[6－9]。肽含量的测定方法之一是将其中的大分子蛋白或多肽用三氯乙酸沉淀掉，然后对上清液中肽的含量进行测定[6－7]。然而，关于三氯乙酸沉淀蛋白酶解液特性的研究报道很少。本文采用不同浓度TCA溶液沉淀罗非鱼肉的A lcalase 2.4L酶解液，通过高效体积排阻色谱分析来考察酶解液中不同分子量组分在TCA溶液中的沉淀情况，旨在对三氯乙酸沉淀多肽的效果进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

奥尼罗非鱼 购于广东湛江霞山水产品市场，将罗非鱼去头、去鳞、去鳍、去内脏，洗净，于采肉机中采肉，－18℃冻藏；A lcalase 2.4L（2.4AU/g） 诺维信公司；TCA、Tris 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；其余试剂 均为分析纯。

DK－98－1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；JJ－1精密增力电动搅拌器 常州澳华仪器有限公司；XW－80A漩涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机 日本日立公司；UV－8000紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；Waters 600半制备高效液相色谱（Waters 600E泵，Waters 2487双波长紫外检测器） 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解液的制备 取鲜冻鱼肉30g匀浆打碎后置于烧杯中，按1∶1（W∶V）比例加水，于55℃恒温水浴锅中预热30m in，按740u/g鱼肉加入A lcalase 2.4L酶，自然pH下分别酶解1、2、5h。沸水灭酶10min，8000r/min离心20m in，得酶解液。

1.2.2 TCA溶液的配制 2%TCA溶液的配制：称取2.00g TCA晶体，于100m L容量瓶中定容。同样的方法配制6%、10%、14%、20%的TCA溶液。

1.2.3 TCA沉淀上清液的制备 取酶解液5m L与等体积TCA溶液混合，漩涡混合20s，静置10m in，4℃、8000r/min离心15min。将上清液转移，定容至50m L，以下简称上清液。

1.2.4 水解度的测定 电位滴定法[10]。

1.2.5 色谱条件 色谱柱：Waters Protein－Pak 60柱（7.8mm×300mm，球形10μm）；柱温：25℃；流动相：Tris－HCl缓冲液（pH7.2，50mmol/L），等度洗脱0.7m L/min；检测波长：214nm；进样量：10μL。

1.2.6 分子量标准曲线 所用标准品为：Triosephosphate isomerase（磷酸丙糖异构酶）、Myoglobin（肌红蛋白）、Aprotinin（抑肽酶）、Oxidized insulin b chain（胰岛素B链）、Bacitracin（杆菌肽）、HHL（马尿酰组氨酰亮氨酸）。

回归方程为：LgM=－0.1992x+6.3107（R2=0.9751）。

式中：M－分子量，u；x－保留时间，m in。

2 结果与分析

2.1 酶解液的水解度

由表1可知，随时间的增加，被裂解的肽键数越来越多，1h和2h水解度差别不大，到5h时水解度增加较多。

表1 酶解液的水解度Table 1 DH of hydrolysate

2.2 不同浓度TCA沉淀上清液的液相色谱图比较

图1A为1%TCA溶液稀释10倍后的高效液相色谱图。可以看出，TCA在214nm波长下具有很强的吸收，其保留时间为12.36m in。图1B～图1G为1h酶解液及其1%、3%、5%、7%、10%TCA沉淀上清液10倍稀释后的液相色谱图。由图可知，TCA吸收峰的大小随浓度的增大而增大。上清液色谱图中第四峰的出峰时间从图1C～图1G依次为12.425、12.367、12.336、12.371、12.323m in，即为TCA峰，其峰面积太大导致其后的2个峰被淹没，TCA浓度越大，这种现象越严重。实验中没有将上清液中的TCA除掉，因而图1C～图1G中TCA峰之后的2个或3个峰的峰面积无法与图1B比较。除此之外，图1B～图1G中其他相应峰的保留时间基本一致，这说明TCA沉淀并未对酶解液中蛋白或肽的分子量造成影响。表2对1h酶解液中各峰的保留时间、分子量和峰面积进行了汇总，同时汇总了上清液色谱图中峰与酶解液色谱图中对应峰的峰面积百分数。2h及5h酶解液、上清液色谱图未给出，表3和表4对其结果进行了描述。

图1 1h酶解液及其不同浓度TCA沉淀上清液的液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of 1h hydrolysate and its supernatant precipitated by different concentration TCA

由表2～表4可以看出，1h、2h及5h酶解液的峰面积总和是增加的，5h酶解液峰面积总和是1h、2h酶解液的1.2及1.1倍。随着酶解反应时间的延长，大分子肽段所占比例减少，小分子肽段所占比增加。酶解液中含量较高的均是9.5ku和2.5ku的肽，1h、2h和5h酶解液中大于9.5ku的分别占22.29%、19.00%及17.89%，小于2.5ku的分别各占7.11%、8.14%及24.03%，3～5.5ku部分约分别为70.60%、72.86%和58.08%，1.5ku以下肽的比例分别是7.10%、8.14%和10.48%。这反映了酶解的进程，也与酶及底物的性质有关。

由表2～表4可以看出，1%、3%、5%、7%、10%TCA对1h、2h及5h酶解液中不同分子量组分都有沉淀作用，19ku与9.5ku的沉淀百分比随TCA浓度的增加而升高，约在52%～59%与57%～63%之间；1.5ku的沉淀百分比随TCA浓度的增加而略有下降，约为65%～38%之间；2.5～2.6ku的沉淀百分比随TCA浓度的增加先增加后略下降，在46%～58%之间；而2.5～1.4ku的沉淀百分比随TCA浓度的增加而下降，在65%～38%之间；1.0ku的沉淀百分比随TCA浓度的增加而下降，在78%～21%之间。可见，不同分子量组分在1%、3%、5%、7%、10%TCA中都有沉淀作用，而且，对不同分子量组分来说，并不一定有随TCA浓度的增加沉淀百分比也增加的结果，相反地，TCA浓度大于5%，随TCA浓度的增加，沉淀百分比呈现减少的趋势。值得注意的是，相比于1h酶解液，1%、3%、5%、7%、10%TCA对2h及5h酶解液中1.5ku以下肽的沉淀百分比要高得多，最高达到78%，这也是不同分子量组分中的最高沉淀率。

Mireille[11]等在研究不同长度的肽与其在TCA中的溶解性时发现，在12%的TCA中可以溶解的肽的残基数在2～20之间，不溶的则在10～65之间；在研究不同的肽在TCA中溶解特性时发现，39种肽在各种TCA浓度中均可溶，有6种肽在各种TCA浓度中均不可溶，30种肽的溶解性随TCA浓度的增加而下降。

Sivaraman[1]在研究不同蛋白在不同TCA中的沉淀时，发现所研究的蛋白在TCA中的溶解特性是随TCA浓度由小到大呈U型曲线，TCA浓度增加到50%时，沉淀的蛋白又开始重新溶解。

可见，蛋白或肽在TCA溶液中的沉淀（溶解）特性很复杂。M ireille[11]等研究认为，三氯乙酸对肽的沉淀作用受到分子量、氨基酸组成、疏水性、肽的浓度及三氯乙酸浓度等方面的影响。

3 结论与讨论

结果表明，1%、3%、5%、7%、10%TCA对罗非鱼肉A lcalase 2.4L的1h、2h及5h酶解液中不同分子量组分都有沉淀作用，9.5ku以上组分的沉淀百分比在47.86%～59.28%之间，2.5～1.4ku的在38.41%～65.49%之间，1.0ku的在21.32%～78.89%之间；TCA浓度大于5%，随TCA浓度增加，沉淀百分比大多呈现减少的趋势。TCA对其他蛋白酶解液的沉淀情况如何有待进一步的研究。采用三氯乙酸沉淀蛋白酶解液中的大分子肽段，然后测定上清液中肽的含量定义为短肽的方法，其准确性也有待深入研究。

表2 1h酶解液与其TCA沉淀上清液峰面积比较Table 2 Peak area compare of 1h hydrolysate to its supernatants precipitated by TCA

表3 2h酶解液与其TCA沉淀上清液峰面积比较Table 3 Peak area compare of 2h hydrolysate to its supernatants precipitated by TCA

表4 5h酶解液与其TCA沉淀上清液峰面积比较Table 4 Peak area compare of 5h hydrolysate to its supernatants precipitated by TCA

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Study on precipitating action of enzymatic hydrolysate of tilapia flesh protein by trichloroacetic acid through HPLC

HAN Dao-cai，YANG Ping*，HONG Peng-zhi
（Food Science and Technology College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

In order to research the effectof TCA p recipitating to p roteins or pep tides in the enzymatic hyd rolysates of tilap ia flesh，the molecular weight d istributions of hyd rolysates by Alcalase 2.4L and the supernatants of hyd rolysates p recip itating by TCA in different concentrations were studied by HPLC.The results ind icated that various pep tides com ing from 1，2，5h hyd roltsate were p recip itated to varying deg rees in 1%，3%，5%，7%，and 10%TCA，while 47.86%～59.28%of the＞9.5ku，38.41%～65.49%of the 2.5～1.4ku，and 21.32%～78.89%of the 1.0ku removed.The p recipitating percentage rised or fellw ith the inereasing of TCA concentrations.

TCA；p recipitating action；enzymatic hyd rolysate；pep tide

TS201.2

A

1002－0306（2012）09－0092－04

2011－08－11 *通讯联系人

韩道财（1988－），男，在读硕士研究生，研究方向：水产品高值化加工与利用。

广东省粤港关键领域重点突破项目（2009A020700004）；广东省海洋渔业科技推广专项项目（A2009002－01（a））。