重组大肠杆菌高密度生产G-CSF发酵工艺优化

刘宁 宋磊 陈文芳 刘红军

重组大肠杆菌高密度生产G-CSF发酵工艺优化

刘宁 宋磊 陈文芳 刘红军

目的优化重组人粒细胞集落刺激因子，以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达。方法 借助正交实验，在14L发酵罐中，研究重组人粒细胞集落刺激因子工程菌在添加不同浓度钾盐、钠盐和镁盐后对质粒稳定性和目的蛋白表达的影响。结果在高浓度盐的环境下，菌株的比生长速率和质粒稳定性均显著提高，从而提高目的蛋白的表达量。结论获得一种高效生产人粒细胞集落刺激因子的方法。

粒细胞集落刺激因子;高盐效应;高密度发酵;质粒稳定性

1 材料

1.1 菌株 重组大肠杆菌GCSF/pET23a/BL21(DE3)由本实验室保存。

1.2 试剂 胰蛋白胨、酵母浸出粉为Oxoid公司产品，IPTG、氨苄青霉素(AMP)为Sigma公司产品，其余均为国药集团分析纯试剂。

1.3 培养基 LB液体培养基(蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L)、LB固体培养基(LB液体培养基+20 g琼脂/L)、发酵基础培养基((NH4)2HPO44 g/L，酵母浸出粉 1 g/L，KH2PO414 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，葡萄糖 2 g/L，微量元素10 ml/L，氨水和稀硫酸调节pH至7.0±0.2)。微量元素储备液(FeSO4·7H2O 1 g/L，MnSO4·H2O 1 g/L，ZnSO4·7H2O 2.78 g/L，CoCl2·6H2O 2 g/L，Na2MO4·2H2O 2 g/L，CuSO45H2O1.85 g/L，H3BO30.5 g/L)。发酵补料培养基1(葡萄糖600 g/L)，发酵补料培养基2(酵母浸出粉100 g/L，Mg-SO4·7H2O 200 g/L，KCL 150 g/L，NaCL 150 g/L)。培养基中AMP的工作浓度为100 mg/L。

1.4 仪器与设备 美国NBS 14 L发酵罐，天津医疗二厂WM-2H无油空压机，日立连续流离心机，尤尼柯紫外可见分光光度计，Bio-Rad蛋白质电泳仪和凝胶成像分析系统。

2 方法

2.1 种子培养 种子的活化和培养为:将-70℃甘油冻存菌转接于5 ml LB液体培养基震荡培养，OD600为0.6～1.0时按1∶100转接于25 ml LB液体培养基继续培养，OD600为0.6左右，转接于800 ml LB，37℃，摇床培养过夜。

2.2 发酵工艺 800 ml种子液接种于8L基础培养中，发酵过程中使用氨水和稀硫酸控制pH为7.0，温度37℃，转速由初始220rpm最高升至800rpm以维持溶解氧浓度(DO)，必要时通纯氧以保证DO高于30%。当DO值突然升高的时候开始流加补料培养基，补料培养基1流加与补料培养基2体积比为1.5∶1，补料流加分为三个阶段:DO-stat流加阶段、指数流加补料阶段、匀速流加补料阶段。当OD600达到40～50，用1 mm异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，发酵时间为18～20 h。

2.3 正交试验研究不同金属盐浓度对质粒稳定性和G-CSF产量的影响 设计钾盐、钠盐、镁盐三因素60 mm、120 mm、180 mm、240 mm四水平的正交试验(表1)。通过流加补料培养基，使培养集中的金属盐浓度分别达到表1中所示。

表1 正交试验因素、水平设计表

2.4 比生长速率与金属盐浓度对质粒稳定性和G-CSF产量的影响 批次1与2均在普通盐浓度下生长表达，批次1在表达阶段平均比生长速率约为0.03 L/h，批次二约为0.07 L/h。批次3与4都在高钾盐镁盐条件下，批次3在表达阶段平均比生长速率约为0.03 L/h，批次4约为0.07 L/h。

2.5 质粒稳定性的检测 使用平行平板法测定［7］。

2.6 G-CSF产量的测定 发酵液离心洗涤后收集菌体，用细胞超声粉碎机粉碎，离心取得包涵体沉淀。加上样缓冲液煮沸溶菌，进行15%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，扫描测定G-CSF表达量。

3 结果

3.1 各因素水平对质粒稳定性和G-CSF产量的影响 通过对表2的分析得出以下结论:对质粒稳定性的影响:A钾盐浓度＞C镁盐浓度＞B钠盐浓度，对G-CSF产量的影响:C镁盐浓度＞A钾盐浓度＞B钠盐浓度。通过实验数据我们可以发现，钾钠镁离子对提高质粒的稳定性上面都起着重要作用，其中钾镁离子的作用随浓度升高效果明显逐渐增强，而钠离子在低浓度时，就起到一定作用。钾镁离子对提高G-CSF产量有着显著作用，而镁离子作用最高。根据主要因素取最高水平，次要因素则根据节约方便的原则，选出C镁盐浓度240 mm，钾盐浓度在180～240 mm之间，钠盐浓度60 mm。3.2 在高浓度钾盐和镁盐下比生长速率对质粒稳定性和GCSF产量的影响

从图1结果可知在普通盐浓度下，低的比生长速率不仅获得高质粒稳定性(55%)，且得到较高的G-CSF产量(1.6 g/L)。在普通盐浓度下，高比生长速率因大幅下降质粒的稳定性(35%)，而使得产量也降低到1.2 g/L，不利于生产。而在200 mm钾盐和240 mm镁盐的高盐条件下，虽然表达阶段高比生长速率使质粒的稳定性由97%降至78%，但是G-CSF的产量却由3.5 g/L提高至4.1 g/L。高浓度金属盐、高比生长速率的培养条件比普通浓度金属盐、低比生长速率的工艺，GCSF产量提高了156%。

表2 试验设计、结果及分析

图1 在高浓度钾盐和镁盐下比生长速率对质粒稳定性和G-CSF产量的影响

4 小结

基因工程产品在医药、保健、食品、环保等方面逐渐表现出其极大的潜在能力和市场占有率，高密度发酵在保证产品质量的前提下可以提高产量，降低成品，随着高密度技术的发展，如何保证含目的基因质粒的稳定性逐渐被人们重视。培养条件及质粒中所携带的外源基因性质、重组菌的生长速率、外源基因的表达水平等因素都会影响质粒稳定性［8-10］。本研究围绕改变重组菌的生长环境方面展开，借助正交实验方法选择出含终浓度240 mm/L镁离子200 mm/L钾离子高浓度金属盐的组成培养基，获得一条在高比生长速率下同样可以明显提高质粒稳定性的发酵工艺，最终使得G-CSF的产量提高了156%，是一条适合工业化的低成本高产出发酵方案。

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The optimiztion of high cell-density culture of G-CSF us recombinamt Escherichia coli

LIU Ning，SONG

Lei，CHEN Fan，et al．Quangang Laboratories Companylimited in Shandong Province，Jinan 250014，China

Objective To optimize the fermentation procedure of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor and to obtain high cell density and high level expression of the aim protein.Methods With orthogonal experiment，study the influence of different concentration potassium，sodium salt and magnesium salt on plasmid stability and expression of aim protein in a 14L fermentor.Results Under high concentrations of salt in the culture，the specific growth rate of strains and plasmid stability were significantly improved，so as to improve the purpose of protein expression.Conclusion Gain a efficient fermentation method to produce recombinant human granulocyte colony-stimulating factor.

G-CSF;High salt-induced;High cell-density culture;Plasmid stability

250014 济南，山东泉港药业有限公司

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)作为第一代重组基因工程药物产品，广泛应用于自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、艾滋病、再生障碍性贫血等疾病的治疗，因其疗效的特异性和确切性，被认为是开发的最为成功的细胞因子生物药物之一。近年来，对基因工程产品生产标准和生产成本的不断提高，原有技术面临着严峻的挑战。原有发酵工艺落后，蛋白表达水平低，随着对大肠杆菌生理代谢进行更深入的探索，使原核系统高密度发酵工艺研究不断发展，例如:乙酸蓄积［1，2］、质粒稳定性等对高密度发酵的影响等。通过改造宿主菌、改变培养基的成分、发酵温度、补料方式和添加抗生素［3-6］等方法，均可影响质粒的稳定性从而改变目的蛋白的表达量，本研究通过改变工程菌的培养条件即在发酵过程中添加高浓度的金属盐如钠盐，钾盐，镁盐，探索适用于产业化的既简单又实用的高产G-CSF发酵策略。