Ⅱa类乳酸菌细菌素的异源表达研究进展

刘国荣，孙 勇，李平兰*

(1.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，食品风味化学北京重点实验室，北京 100048；2.北京市食品研究所，北京 100162；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

Ⅱa类乳酸菌细菌素的异源表达研究进展

刘国荣1,3，孙 勇2，李平兰3,*

(1.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，食品风味化学北京重点实验室，北京 100048；2.北京市食品研究所，北京 100162；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

Ⅱa类乳酸菌细菌素由于其对单核细胞增生李斯特菌的强烈抑菌活性，已成为天然食品防腐剂研究与开发的热点。但是受生物合成调控系统控制，天然细菌素的产量往往很低而且提取过程较为复杂，很难满足相关研究和实际应用的需求。为此，许多研究者进行过Ⅱa类细菌素的异源表达研究，本文对该类细菌素在大肠杆菌、乳酸菌以及酵母菌中的异源表达研究作较为全面系统的综述，并指出目前存在的主要问题及今后的研究方向。

Ⅱa类乳酸菌细菌素；单核细胞增生李斯特菌；异源表达

乳酸菌及其活性代谢产物与人类的健康密切相关，常常被有意识地引进食品产品或自然地发生在食品中，从而使食品拥有人们渴望的风味、结构、营养及安全性。乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，它在人体内可被降解，具有无毒、无残留，高效、耐酸、耐高温、无抗药性等特点，目前已成为天然防腐剂研究与开发的热点[1-2]。

Ⅱa类乳酸菌细菌素，是指一类具有共同N端YGNGVXaaC序列的抗李斯特菌的小肽，它们是乳酸菌细菌素中数量最多且研究最为深入的一群，主要包括片球菌素(pediocin)、肠球菌素(enterocin)等小分子细菌素。这类细菌素不仅可以强烈抑制食源性病原菌单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocylogenes)的生长，而且对某些腐败乳酸菌、索丝菌(Brochotrixspp.)、梭状杆菌(Clostridiumspp.)、芽孢杆菌(Bacillusspp.)、葡萄球菌(Staphylococcusspp.)等都表现有明显抑制作用，具有很好的控制食品腐败菌及病原菌的潜在应用价值。此外，与其他细菌素相比，Ⅱa类细菌素的抑菌活性较强且具有良好的物理化学性质，是目前公认的最有希望应用于多种工业用途的细菌素[3-4]。

目前，Ⅱa类乳酸菌细菌素的获得主要是通过天然生物合成，但是由于其受调控系统的影响，产量往往比较低，而且从机体中提取步骤复杂、得率低，不足以进行抑菌作用机制、构效关系及开发应用研究。另有少量研究报道可以采用化学方法合成细菌素，它是依据细菌素的天然氨基酸序列和活性结构特点，通过固相法合成的细菌素或类似物，但是价格比较昂贵，也很难满足细菌素相关研究和实际应用的需求。随着Ⅱa类细菌素遗传学特征的深入研究及基因工程技术的广泛应用，很多学者发现通过异源分泌表达生产细菌素可克服这些不足。已有研究显示，不同来源的不同属、种的乳酸菌可以产生相似的Ⅱa类细菌素，这说明编码Ⅱa类细菌素的基因在不同菌株之间是可以转移的[5-7]。

许多实践证明，通过异源表达生产Ⅱa类乳酸菌细菌素可以：1)提高细菌素的产量，以便进行细菌素的作用模式、结构与功能及应用性研究；2)减少在目标细胞中细菌素抗性的发生，提高其在食品中的抗菌效率；3)在更安全的宿主中生产细菌素；4)构建出对多种不良微生物都有抑菌活性的细菌素产生菌；5)构建出对食品环境有更好适应性的重组宿主；6)为乳酸菌提供更好的抗菌特性，使其在作为食品发酵剂、益生菌制剂、饲料添加剂等时能更好的发挥作用[8]。Ⅱa类乳酸菌细菌素的异源表达研究，不仅可为全面解析Ⅱa类乳酸菌细菌素的异源分泌机制提供直接证据，也可为Ⅱa类乳酸菌细菌素的工业化生产和应用提供有效途径，并进一步推动我国食品天然生物防腐剂的快速发展。

近年来，有许多研究学者进行了乳酸菌细菌素异源表达研究，取得了大量的重要成果。本文重点综述了Ⅱa类乳酸菌细菌素在大肠杆菌、乳酸菌以及酵母菌中的异源表达研究。

1 Ⅱa类乳酸菌细菌素的异源表达概况

乳酸菌细菌素异源表达或基因工程技术的研究从20世纪90年代开始，在国外逐渐成为热点，尤其在欧洲诸国研究居多，国内近五年开始出现报道。通过文献检索发现，已有近20种乳酸菌细菌素在10多种宿主菌中表达，使用的表达宿主包括大肠杆菌、乳酸菌、酵母菌等，其中表达的Ⅱa类乳酸菌细菌素主要有Pediocin PA-1、Enterocin A、Enterocin P、Carnobacteriocin B2、Divercin V41、Piscicolin 126、Mesentericin Y105、Plantaricin 423、Hiracin JM79等，见表1。

表1 已报道Ⅱa乳酸菌类细菌素异源表达Table 1 Previous studies on the heterogenous expression of class Ⅱa bacteriocins from lactic acid bacteria

2 大肠杆菌异源表达系统

大肠杆菌是细菌素异源表达研究中使用最多的宿主，这首先是因为大多数乳酸菌细菌素对大肠杆菌并不表现抑制活性，所以不必担心细菌素对宿主菌的细胞毒性作用。其次是因为大肠杆菌表达系统是目前最完善的异源表达体系，它的主要优点包括：人们对其遗传背景、分子生物学特点、生物化学特性等方面有较深入的认识，易于人为改造；很多目的基因在大肠杆菌中都能迅速而有效地表达出目的蛋白，通常能获得目的蛋白占总蛋白30%～40%的工程菌株；大肠杆菌的培养条件简单，表达条件易于控制，生产成本低廉；很多成熟的表达载体及宿主菌组合可供选择，研究者可根据需要选择最适组合。目前大肠杆菌表达系统已被广泛用于各种工具酶的生产、抗原及疫苗的制备、细胞因子的生产、结构生物学的研究等方面[28]。

对Ⅱa类细菌素而言，由于大肠杆菌不能编码前导肽切除酶，不能对Ⅱa类细菌素前体的前导肽进行切除，因此，通常采用的表达策略是直接将成熟Ⅱa类细菌素基因编码序列克隆到大肠杆菌表达系统中，利用大肠杆菌自身的分泌机制进行分泌表达。产物多数不能成功分泌到胞外，大部分以胞内融合蛋白形式表达，而且产物产量和活性差异较大且其分离纯化过程涉及细胞裂解、酶解等，过程繁琐，成本较高[8]。另外，大肠杆菌高效表达系统还容易形成包涵体，致使重组蛋白的提取、纯化及复性过程更加困难。此外，由于大肠杆菌菌株本身不具有食品应用特性，因此仅表达产物可用于食品工业，有一定的局限性。

近年来，已有许多Ⅱa类细菌素在大肠杆菌中的异源表达研究报道。早在1998年，Miller等[29]就利用PMAL-p2x载体在大肠杆菌中分泌表达了麦芽糖结合蛋白(MBP)-pediocin AcH，并发现该融合蛋白具有与天然Pediocin AcH相似的生物学活性。这个实验首次证明了可以利用大肠杆菌的标准信号肽依赖机制进行Ⅱa类细菌素的功能性分泌表达。随后，其他一些Ⅱa类细菌素利用大肠杆菌异源表达生产的研究也陆续被报道，如Moon等[19]将Pendiocin PA-1成熟肽基因与带有His-tag的仓鼠二氢叶酸还原酶基因序列融合，在大肠杆菌细胞质内成功表达了His-tag-仓鼠二氢叶酸还原酶-pendiocin PA-1，并发现在利用Xa因子蛋白酶切除融合标签后，重组Pendiocin PA-1具有与天然细菌素相似的活性，但是产量仅有0.06mg/L。如Richard等[11]依据大肠杆菌密码子嗜好性，设计合成Divercin V41成熟肽基因，与表达载体pET-32b中的含有硫氧还原蛋白基因的核苷酸序列融合，在大肠杆菌细胞质内成功表达了可溶性的硫氧还原蛋白-His-tag-divercin V41，该重组蛋白切除融合标签后具有较高的抗李斯特菌活性，纯化后产量可达23mg/L。又如Gibbs等[25]将细菌素Piscicolin 126基因片段克隆到表达载体pET-32a上，并配合使用能够在细胞质内形成二硫键的宿主菌，融合表达了硫氧还原蛋白-piscicolin 126，切除融合标签后的重组Piscicolin 126具有生物活性，且产量高达26mg/L。通过这些成功的例子可以看出，采用以上表达系统可以获得大量可溶性的融合目的蛋白，但是存在的共同问题就是目的蛋白只有在切除融合标签后才显示与天然细菌素相似的抑菌活性，不利于细菌素的工业化生产和应用。

本课题组前期研究建立了Ⅱa类细菌素Enterocin P在大肠杆菌中的高效异源表达系统，所得重组细菌素产量高达32mg/L[5,30]。该系统所采用的表达载体为pET-22b(+)，它的N端含有pelB信号肽序列，为分泌型表达载体，它可以增加重组蛋白的溶解性、引导其穿过细胞质膜，进入细胞周质内。而由于细胞周质的氧化环境更有利于蛋白折叠和二硫键的形成，所以有利于获得可溶的活性蛋白[31]。此外，该载体C端含有6×His标签序列，该融合标签的存在有利于在天然条件下用金属亲和层析纯化融合蛋白并阻止大肠杆菌细胞内蛋白酶对细菌素的降解，同时重组蛋白分子上仅融合了6个组氨酸短肽，可使重组细菌素在结构和特性上都更加接近天然Enterocin P。

3 乳酸菌异源表达系统

已有许多研究发现，产生细菌素的发酵剂在发酵过程中可以防止或抑制不良菌的污染，因而将产细菌素的乳酸菌加入到食品中比直接加细菌素更简便、安全。但是并不是所有的工业乳酸菌都可产生细菌素，产生细菌素的菌株也并不一定适应细菌素发挥作用的环境，因此可以将细菌素基因导入不产生细菌素的发酵剂菌株中而使其获得细菌素产生的能力，既可以发酵食品，又可以抑制食品中的腐败菌和病原菌。而且不同的食品级乳酸菌菌株可基于它们在特定食品中的特性被选择在不同食品中作为细菌素宿主，从而可构建出适应于不同类型食品的细菌素产生菌株。

与大肠杆菌表达系统相比较，乳酸菌表达系统获得相对困难，但是乳酸菌本身安全且能够将目的蛋白分泌到胞外，可放心应用于食品工业化生产[8]。截止目前，以乳酸菌为宿主异源表达细菌素的研究报道非常少，存在的主要问题是细菌素异源分泌表达水平太低，如Sanchez等[18]利用乳酸乳球菌表达细菌素Hiracin JM79，获得了胞外活性重组细菌素，但是抑菌活性明显低于原宿主菌株。

此外，还有许多学者致力于构建完全食品级异源表达系统来生产Ⅱa类乳酸菌细菌素。这是考虑到传统的乳酸菌表达载体大多以红霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作为筛选标记，虽然这可以为遗传操作保持一定的选择压力并有效选择转化子，但是将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于存在抗性因子转移的隐患，可能带来生物安全性的严重后果，所以从食品安全角度考虑，含抗生素抗性基因标记的微生物不能应用于食品生产中[32]。而为了防止使用抗生素抗性标记所引起的危害，最有效的办法是选用对人体安全的食品级筛选标记替代抗生素抗性标记以构建食品级受体及载体系统。

本课题组前期也研究了Ⅱa类细菌素Enterocin P在食品级乳酸菌中的异源表达与分泌，所使用的是食品级表达载体pLEB590，该载体完全以乳酸乳球菌DNA构建的，它包含pSH 7l复制子，组成型启动子P45，并以Nisin免疫基因nisI为标记基因[16]。对Nisin敏感的宿主菌因电转化导入pLEB590而对Nisin产生免疫性，这为它的应用带来了极大的方便。此外，提供选择压力的物质Nisin是公认安全的天然食品防腐剂，且nisI基因来源于乳酸菌自身，这使得将nisI基因作为乳酸菌食品级筛选标记更有优势。该研究结果不但拓展了乳酸乳球菌食品级表达载体的应用范围，而且为开发产Ⅱa类细菌素的工业化发酵剂、益生菌制剂等奠定了坚实基础。目前，课题组在验证了pLEB590能够表达Ⅱa类细菌素基因的基础上，开始对载体pLEB590进行改进，将组成型启动子P45换成诱导型启动子，如PnisA-MCSTpepN。即构建以nisI作为食品级选择标记的NICE高效诱导表达系统。

4 酵母菌异源表达系统

酵母菌是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。而且某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。

以酵母菌为宿主异源表达细菌素的报道相对较少，其表达宿主菌主要有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。目前，存在的主要问题是宿主特异性使得产物常常出现无活性或活性很低的现象，如Sanchez等[18]利用毕赤酵母表达细菌素HirJM79，结果发现，培养基对其抑菌活性影响较大，重组细菌素的产量明显高于野生菌株，但是活性却远不及野生菌；van Reenen等[26]利用酿酒酵母表达Plantaricin 423，其工程菌表现出了抑菌活性，但培养上清液中却未检测出抑菌能力。Beaulieu等[22]利用毕赤酵母表达片球菌素Pediocin PA-1，虽然获得了胞外的重组片球菌素，但却未检测出生物抑菌活性。以上均表明构建高产且高活性细菌素的酵母工程菌是可行的，但仍需探索更为优良的表达体系。

5 结 语

纵观Ⅱa类细菌素异源表达研究现状可以看出，构建高产且高活性细菌素的基因工程菌是可行性的，但存在以下主要问题：细菌素的异源分泌水平太低；某些异源表达系统仅适合特定菌株及细菌素。除解决以上问题外，未来还可以进行以下几个方面的探索研究。

5.1 在用于食品发酵的乳酸菌中表达外源Ⅱa类细菌素基因

并不是所有的工业乳酸菌都可产生细菌素，产生细菌素的菌株也并不一定适应细菌素发挥作用的环境，因此可以将细菌素基因导入不产生细菌素的发酵剂菌株中而使其获得细菌素产生的能力，既可以发酵食品，又可以抑制食品中的腐败菌和病原菌，甚至可以根据不同食品级乳酸菌菌株在特定食品中的特性而选择不同食品级乳酸菌作为细菌素异源表达宿主，进而构建出适应于不同类型食品的细菌素产生菌。

5.2 建立Ⅱa类乳酸菌细菌素在芽孢杆菌中的异源表达系统

由于芽孢杆菌表达载体转化效率低、表达产物量少以及产物活性受环境影响大等因素，使得有效芽孢杆菌分泌表达系统的构建和获得非常困难，目前有关细菌素在芽孢杆菌中的异源表达还未见研究报道。但是芽孢杆菌具有良好的分泌特性，其发酵工艺和产物回收技术也较为成熟，用作细菌素的分泌型宿主菌，具有很大的潜力。

5.3 将无细胞蛋白质合成系统应用于Ⅱa类细菌素的重组表达

近几年，无细胞蛋白质合成系统迅速发展，该系统能使外源基因在体外快速表达，避免了细胞体系中宿主菌的复杂调控和新陈代谢带来的干扰，以及基因工程菌表达抗菌肽时对宿主的毒性作用，可以成为Ⅱa类细菌素重组表达的一种有效手段。然而，到目前为止，国内外只有谢燕[33]利用大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统实现了Ⅱa类细菌素NB-C1融合蛋白的可溶性表达。这说明有关Ⅱa类细菌素在无细胞蛋白质合成系统中的重组表达研究上还存在很大的探索和发展空间。

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Research Advances in Heterologous Expression of ClassⅡa Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria

LIU Guo-rong1,3，SUN Yong2，LI Ping-lan3,*
(1. Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China；3. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Class Ⅱa bacteriocins from lactic acid bacteria, which have a strong antibacterial activity againstListeria monocytogenes, have become a hot topic in the research and development of natural preservatives. However, the bacteriocins are always produced at very low levels under the control of the biosynthesis regulatory system and their extraction is very complex, which makes it very difficult to meet the demands for relevant studies and practical applications. For this reason, the heterogenous expression of classⅡa bacteriocins has been widely studied in recent years. This paper summarizes a comprehensive systematic review of recent studies on the heterogenous expression of the bacteriocins inE. coli, lactic acid bacteria and yeast and points out the current main problems and future research directions.

classⅡa bacteriocins；Listeria monocytogenes；heterologous expression

Q939.117

A

1002-6630(2012)05-0323-05

2011-12-12

北京工商大学青年教师科研启动基金项目(QNJJ2011-042)；国家自然科学基金项目(31071591)

刘国荣(1983—)，女，讲师，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail：liuguorong@th.btbu.edu.cn

*通信作者：李平兰(1964—)，女，教授，博士，研究方向为乳酸菌及其活性代谢产物的理论与应用。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn