海藻酸钠固定瑞士乳杆菌条件优化

郭宇星，潘道东,2,*，刘 洋，王翠翠

(1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

海藻酸钠固定瑞士乳杆菌条件优化

郭宇星1，潘道东1,2,*，刘 洋1，王翠翠1

(1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

采用海藻酸钠固定瑞士乳杆菌，制备具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的酸乳，通过单因素试验和L9(34)正交试验确定其最优固定条件。结果表明，最优固定条件是1.5g/100mL海藻酸钠溶液、菌液浓度1:10(m/V)、0.1mol/L CaCl2溶液、固定时间1h。将固定化的瑞士乳杆菌与传统酸乳发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)复配接入到11g/100mL牛乳中，在37℃条件下发酵至凝乳，凝乳时间为8h，pH值为4.2，凝乳状态好，口感柔和、细腻，成品酸乳ACE抑制活性为70.3%。

固定化；海藻酸钠；瑞士乳杆菌；血管紧张素转移酶抑制活性

血管紧张素转化酶(angiotensin-I converting enzyme，EC3.4.15.1，ACE)抑制肽指的是一类具有抑制ACE活性的肽类物质。ACE抑制肽在人体血压调节过程中起着重要的生理作用，所以又被称作为降血压肽。来源于乳蛋白的ACE抑制肽，其降压效果虽不及合成药物强烈，但无副作用，安全可靠[1-6]。乳源ACE抑制肽主要是乳蛋白质水解物和一些乳酸菌发酵乳制品，在众多乳酸菌中，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)蛋白水解能力较强，制作的酸乳含有高活性的ACE抑制肽[7]。如Nakamura 等[8-9]用Lactobacillus helveticus和Saccharomyces cerevisiae作为发酵剂制作了一种名为Calpis的酸乳饮料，原发性高血压小鼠(SHR)长期服用Calpis后，可抑制血压上升。Yamamoto等[10]报道从瑞士乳杆菌CPN4菌株的发酵乳中分离到具有抑制ACE活性及降高血压功能的乳蛋白水解肽。在国内，潘道东等[11-12]采用瑞士乳杆菌JCM1004制备酸乳，并且从酸乳中分离到ACE 抑制肽，通过SHR动物实验表明此发酵乳抗血压升高的作用比较显著。

海藻酸钠是由α-L-古洛糖醛酸钠(α-L-guluronate，简称G )和β-D-甘露糖醛酸钠(β-D-mannuronate，简称M) 1、4连接的长链线性多糖，海藻酸盐分子链G块容易与Ca2+作用，2条分子链G块间形成一个洞，结合Ca2+外形成蛋盒模型，形成热不可逆凝胶，具有较好的生物相容性和生物可降解性，从而将瑞士乳杆菌固定化在凝胶网络中[13]。瑞士乳杆菌固定化后可重复使用，并可实现连续化或半连续化发酵生产ACE抑制肽[14-18]。

本实验采用海藻酸钠包埋法将瑞士乳杆菌固定，采用单因素与正交试验确定海藻酸钠固定瑞士乳杆菌的最优工艺条件，以固定化瑞士乳杆菌为发酵剂制备高活性降血压肽酸乳，旨在为降血压肽的高效制备提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)15019 本实验室筛选保藏；海藻酸钠 成都市科龙化工试剂厂；Hip-His-Leu 美国Sigma公司；传统酸乳发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌) 市售；其他试剂均购自上海久亿化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SA-910型超净工作台 上海上净净化设备有限公司；PHS-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂；紫外-可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；CL-22M高速冷冻离心机 赛特湘仪离心机仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HH-S11-2电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 海藻酸钠固定瑞士乳杆菌单因素条件研究

1.3.1.1 海藻酸钠质量浓度的选择

以海藻酸钠质量浓度1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/100mL的海藻酸钠分别对瑞士乳杆菌进行固定化，0.100mol/L CaCl2作为聚凝剂，固定时间为2h，菌液浓度1:10，观察其成珠状况。以固定化瑞士乳杆菌酸乳凝乳时间、凝乳状态为评价指标，确定最佳海藻酸钠溶液质量浓度。

1.3.1.2 CaCl2溶液浓度的选择

以浓度为0.050、0.075、0.100、0.125、0.150mol/L的CaCl2溶液作为聚凝剂，1.5g/100mL 海藻酸钠为载体，菌液浓度1:10，固定化时间为2h进行瑞士乳杆菌固定化，观察其成珠状况。以固定化瑞士乳杆菌酸乳凝乳时间、凝乳状态为评价指标，确定最佳CaCl2溶液浓度。

1.3.1.3 固定时间的选择

以1.5g/100mL海藻酸钠为载体，0.100mol/L CaCl2作为聚凝剂，菌液浓度1:10，对瑞士乳杆菌分别固定0、0.5、1.0、1.5、2.0h。以固定化瑞士乳杆菌酸乳凝乳时间、凝乳状态为评价指标，确定最佳的固定化时间。

1.3.1.4 瑞士乳杆菌菌液浓度的选择

选取菌液浓度1:5、1:10、1:15、1: 20、1:25、 1:30的瑞士乳杆菌菌液，以1.5g/100mL的海藻酸钠为载体，0.100mol/L CaCl2作为聚凝剂，对瑞士乳杆菌固定1h。以固定化瑞士乳杆菌酸乳凝乳时间、凝乳状态为评价指标，确定最佳的瑞士乳杆菌菌液浓度。

1.3.2 海藻酸钠固定瑞士乳杆菌条件优化

以海藻酸钠溶液质量浓度、CaCl2溶液浓度、固定时间和瑞士乳杆菌菌体浓度做四因素三水平正交试验(L9(34))，以固定化瑞士乳杆菌酸乳凝乳时间为评价指标，确定各因素对结果的影响大小，选出最优的固定方法，每个试验做3组平行。

1.3.3 固定化瑞士乳杆菌制备富含ACE抑制肽酸奶

按照优化的海藻酸钠固定化条件制备固定化瑞士乳杆菌，与传统酸乳发酵剂(保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)复配制备ACE抑制肽酸乳。采用Minitab 14软件进行双因子方差分析和主成分分析观察固定化瑞士乳杆菌和传统酸乳发酵剂对发酵酸乳感官、凝乳时间、pH值及ACE抑制活性的影响。

将乳粉配制成11g/100mL的复原乳，按一定比例接入酸乳发酵剂，37℃培养至凝乳取出，测定酸乳的凝乳时间、终产品pH值、ACE抑制活性、感官评分。酸乳发酵剂分4组：A组：未固定瑞士乳杆菌；B组：固定化瑞士乳杆菌；C组：未固定瑞士乳杆菌＋传统酸乳发酵剂；D组：固定化瑞士乳杆菌＋传统酸乳发酵剂，发酵剂总接种量都为体积分数3%。每组实验做3组平行。

1.4 瑞士乳杆菌菌体制备

将瑞士乳杆菌菌体冻干粉(－80℃冷藏)接种于MRS培养基，连续活化3代，按3mL/100mL接种量接种于1L MRS培养基中，37℃条件下扩大培养至生长对数期取出，4℃、4500r/min离心20min收集菌体沉淀。用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)缓冲液洗涤菌体，4℃、4500r/min离心20min弃上清液，重复洗涤3次，收集菌体备用。

1.5 海藻酸钠固定瑞士乳杆菌

取一定量的瑞士乳杆菌菌液加入到一定质量浓度的海藻酸钠溶液中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，静置片刻，用10mL注射器吸取混合液，以10cm左右的高度逐滴注入到一定浓度的CaCl2溶液中，形成胶珠，浸泡一段时间使之固定化，然后取出用无菌生理盐水洗去胶珠表面的CaCl2溶液，于4℃冰箱中贮存备用。

1.6 酸乳的制备

将11g乳粉缓慢加入到100mL温度为50～60℃的热水中，加热至95℃，保温20min进行杀菌处理，降至室温备用。将发酵剂接入到11g/100mL复原乳中, 于37℃恒温发酵至凝乳，记录凝乳时间，观察凝乳状态，测定酸乳pH值，进行感官评分，测定酸乳ACE抑制肽活性。

1.7 指标测定

1.7.1 酸乳pH值测定

采用pH计进行精确测量。

1.7.2 感官评定方法

以口感、组织状态、凝乳状态为感官评定指标。由于这三者在评定酸乳产品质量中的重要性有所不同，故分别对其赋予不同的权重：口感30%，组织状态30%，凝乳状态40%。由8位具有感官评定经验的评价人员进行评定，满分为100分，具体感官评定标准参照表1。

表1 感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards

1.7.3 ACE抑制活性测定

采用Cushman等[19]的方法，用含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.3)将Hip-His-Leu配成5.0mmol/L的溶液。在10mL试管中加入200μL的5.0mmol/L Hip-His-Leu溶液和200μL样品，于37℃保温3min后，再加入20μLACE溶液(溶解于蒸馏水中，活力为0.1U/mL)，混匀后在37℃保温30min，再加入250μL的1.0mol/L盐酸溶液以终止反应，再加入1.7mL醋酸乙酯，经15s振荡混匀后，静置5min，用移液管吸取1.0mL醋酸乙酯层，120℃烘箱烘干，加入1.0mL蒸馏水，混匀后在228nm波长处测定吸光度。

式中：A为添加ACE抑制肽时，ACE和Hip-His-Leu反应的吸光度；B为不添加ACE抑制肽时，ACE和Hip-His-Leu反应的吸光度。

2 结果与分析

2.1 海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌单因素条件研究

2.1.1 海藻酸钠质量浓度的选择

表2 海藻酸钠溶液质量浓度对成珠状况的影响Table 2 Effect of sodium alginate concentration on microcapsule formation

图1 海藻酸钠溶液质量浓度对固定化瑞士乳杆菌活力的影响Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on coagulation activity of immobilized Lactobacillus helveticus

海藻酸钠溶液浓度会影响所成胶珠的大小，从而影响成胶强度和发酵速度。表2和图1结果表明，海藻酸钠溶液质量浓度为1.0g/100mL时，凝乳时间较短，该质量浓度时成珠较易，但成珠太软，易破裂；海藻酸钠溶液质量浓度为1.5g/100mL时，凝乳时间最短，其成珠也较容易，且胶珠强度适中，说明此时固定化瑞士乳杆菌活力较高；海藻酸钠溶液质量浓度大于1.5g/100mL时，发酵速度变慢，凝乳时间延长，成珠也越困难，强度高，不利于生产使用。由此可见，海藻酸钠质量浓度太小，凝胶的孔径较大，固定化菌体容易流失，固定化效率不高，所以酸乳凝乳时间长。而当海藻酸钠质量浓度过高，溶液黏性增强，固定化操作不便，且成珠困难，而且海藻酸钠浓度越大，凝胶的孔径越小，瑞士乳杆菌菌体和底物的接触几率越小。所以综合考虑凝乳时间、成珠状况，瑞士乳杆菌固定化选用质量浓度1.5g/100mL的海藻酸钠溶液包埋为宜。

2.1.2 CaCl2溶液浓度的选择

表3 CaCl2溶液浓度对成珠状况的影响Table 3 Effects of CaCl2 concentration on microcapsule formation

CaCl2溶液的浓度影响凝胶珠的凝固时间以及凝胶珠的表面强度。CaCl2中的钙离子与海藻酸根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶，从而将细胞固定。表3和图2结果表明，用浓度为0.1mol/L CaCl2溶液作为聚凝剂时成珠容易，硬度适中，凝乳时间较短。随着CaCl2浓度的增加，酸乳凝乳时间变长，说明固定化瑞士乳杆菌活力较低，可能是由于盐的高渗透压作用引起细胞脱水，致使微生物活性部分丧失，也可能由于过高的CaC12浓度使得海藻酸钠网格状结构致密，使底物向内扩散和产物向外扩散变得更加困难，表观为凝乳时间变长。CaC12量太少又会导致凝胶强度太小，包埋不完全，从图中也可以看到，CaCl2浓度小于0.1mol/L时，酸乳凝乳时间较长。综合考虑成珠状况以及凝乳时间，瑞士乳杆菌固定化采用0.1mol/L CaCl2作为聚凝剂为宜。

图2 CaCl2溶液浓度对固定化瑞士乳杆菌活力的影响Fig.2 Effect of CaCl2 concentration on coagulation activity of immobilized Lactobacillus helveticus

2.1.3 固定时间的选择

图3 固定时间对固定化瑞士乳杆菌活力的影响Fig.3 Effect of immobilization duration on coagulation activity of immobilized Lactobacillus helveticus

海藻酸钠在CaCl2溶液中交联的时间长短也会对固定化瑞士乳杆菌细胞活性产生影响。由图3可见，固定时间小于1h时，由于固定时间太短，凝胶强度太小，包埋不完全，瑞士乳杆菌活性较低，表现为酸乳凝乳时间较长。固定时间为1h时，凝胶小球强度合适，凝乳时间最短，说明此时瑞士乳杆菌包埋量最适。当固定时间继续延长时，酸乳凝乳时间反而下降，而且所得固定化凝胶小球的强度越高，说明凝胶小球内部的结构紧密，不利于基质的传递，从而使细胞失活率增大。这与唐三三等[20]报道的相一致，海藻酸钠与CaC12形成凝胶是Ca2+通过海藻酸钠胶囊由外向内置换Na+而形成海藻酸钙，因而需要一定量的置换时间，但如果固定化时间太长，交联程度高，形成的凝胶结构太紧密，从而影响到反应速率。

2.1.4 瑞士乳杆菌菌液浓度的选择

图4 瑞士乳杆菌菌液浓度的选择Fig.4 Effect of Lactobacillus helveticus cell concentration on its coagulation activity

由于海藻酸钙小球容积一定，瑞士乳杆菌菌体包埋量也是一定的。由图4可知，当瑞士乳杆菌菌液浓度为1:10时，酸乳凝乳时间最短，此时再增加瑞士乳杆菌菌体，凝乳时间也不再变化，说明在此实验条件下瑞士乳杆菌饱和菌浓为1:10。

2.2 固定化瑞士乳杆菌条件优化

表4 L9(34)正交试验表Table 4 L9(34) orthogonal experimental design table

从表4可知，各因素对固定化瑞士乳杆菌发酵酸乳凝乳时间影响的主次顺序依次为：D＞C＞B＞A，即菌液浓度＞固定时间＞CaCl2溶液浓度＞海藻酸钠溶液质量浓度。最优固定化瑞士乳杆菌条件为A1B2C1D1和A2B2C1D1，在9组试验中，最优的固定化条件为A2B2C1D1，故进行验证实验，实验重复3次。在A1B2C1D1条件下，固定化瑞士乳杆菌凝乳时间为(9.5±0.15)h，在A2B2C1D1条件下凝乳时间为(10.0±0.15)h。故最后确定海藻酸钠固定瑞士乳杆菌的条件为海藻酸钠溶液质量浓度1.5g/100mL，CaCl2浓度0.1mol/L，固定化时间1h，瑞士乳杆菌菌液浓度1:10。

2.3 固定化瑞士乳杆菌制备富含ACE抑制肽酸乳

图5 海藻酸钠固定瑞士乳杆菌制备酸乳的凝乳实验Fig.5 Comparison of properties of yogurts made using different fermentation starters

由图5可知，采用海藻酸钠固定瑞士乳杆菌制备的酸乳ACE抑制活性为70.3%，与未固定化瑞士乳杆菌制备的酸乳ACE抑制活性相比有所提高。但用单一瑞士乳杆菌发酵酸乳，酸乳凝乳时间较长，凝乳状态不好，而且有大量的乳清析出，而将瑞士乳杆菌与传统酸乳发酵剂进行复配发酵，酸乳凝乳时间缩短了近4h，酸乳pH值由原来5.3降至4.8，并且感官评分也较高，产品ACE抑制活性不受影响。从表5可以看到，瑞士乳杆菌有无固定化对酸乳ACE抑制活性有显著影响；而有无添加传统酸乳发酵剂对酸乳的感官评分和pH值有显著影响。综上，固定化瑞士乳杆菌对于酸乳的ACE抑制活性有较大影响，传统酸乳发酵剂对酸乳品质有较大影响，添加传统酸乳发酵剂可提高酸乳的凝乳时间、降低酸乳pH值、提高其感官品质。所以，采用固定化瑞士乳杆菌和传统酸乳发酵剂共同发酵，可制备出具有高ACE抑制活性，且感官品质良好的酸乳。

表5 凝乳实验双因子方差分析P值Table 5 P-value obtained in two-way ANOVA

3 结 论

瑞士乳杆菌是近些年研究较多的用于制备ACE抑制肽的菌种，但采用游离瑞士乳杆菌不能连续生产ACE抑制肽，例如瑞士乳杆菌每次需活化、扩大培养后制成工作发酵剂才能使用；终产品分离提纯也较繁琐。因此，本实验通过单因素和正交试验确定了海藻酸钠固定瑞士乳杆菌的最优条件为：海藻酸钠溶液质量浓度1.5g/100mL，CaCl2溶液浓度为0.1mol/L，固定化时间为1h，瑞士乳杆菌菌液浓度为1:10，并得到影响海藻酸钠固定化瑞士乳杆菌条件的各因素主次顺序依次为：瑞士乳杆菌菌液浓度＞固定时间＞CaCl2溶液浓度＞海藻酸钠溶液质量浓度。

以固定化瑞士乳杆菌为发酵剂制备高活性降血压肽酸乳，得到固定化瑞士乳杆菌制备富含ACE抑制肽酸奶的最佳工艺条件为：将乳粉配制成11g/100mL的复原乳，接入固定化瑞士乳杆菌和传统酸乳发酵剂，在37℃培养至凝乳取出，凝乳时间为8h，pH值为4.2，凝乳状态好，口感柔和、细腻，ACE抑制活性为70.3%。

综上，采用海藻酸钠固定瑞士乳杆菌制备高ACE抑制活性的酸奶是可行的，此项工作为降血压肽的高效制备提供了研究基础。后续工作将开展固定化瑞士乳杆菌生物反应器的研究，用于连续生产ACE抑制肽，这对功能性食品市场的开发具有一定的意义。

[1] YAMAMOTO N, TAKANO T. Antihypertensive peptides derived from milk proteins[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 1999, 43 (3): 159-164.

[2] PIHLANTO-LEPPA..LA.. A. Bioactive peptides derived from bovine whey proteins: opioid and ace-inhibitory peptides[J]. Trends in Food Science and Technology, 2001, 11(9/10): 347-356.

[3] 吴玲, 潘道东. 发酵乳抗高血压特性的研究[J]. 食品科学, 2005, 26 (9): 446-459.

[4] 吕桂善, 霍贵成. 乳及乳制品中的抗高血压活性肽[J]. 中国乳品工业, 2002, 30(5): 53-56.

[5] 郭宇星, 陈庆森. 微生物发酵法制备乳源性ACE抑制肽的研究新进展[J]. 食品科技, 2003(3): 12-16.

[6] 于志鹏, 赵文竹, 刘博群, 等. 血管紧张素转化酶抑制肽研究进展[J].食品科学, 2010, 31(11): 308-311.

[7] 吴正钧, 叶锦, 郭本恒. 乳酸菌的抗高血压作用[J]. 乳业科学与技术, 2004, 27(1): 1-8.

[8] NAKAMURA Y, YAMAMOTO N, SAKAI K, et al. Purification and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitors from sour milk[J]. Journal of Dairy Science, 1995, 78(4): 777-783.

[9] NAKAMURA Y, YAMAMOTO N, SAKAI K, et al. Antihypertensive effect of sour milk and peptides isolated from it that are inhibitors to angiotensin Ⅰ-converting enzyme[J]. Journal of Dairy Science, 1995, 78 (6): 1253-1257.

[10] YAMAMOTO N, MAENO M, TAKANO T. Purification and characterization of an antihypertensive peptide froma yogurt-like product fermented byLactobacillus helveticusCPN4[J]. Journal of Dairy Science, 1999, 82(7): 1388-1393.

[11] 潘道东, 徐德闯, TANOKURA M. 瑞士乳杆菌JCM 1004发酵乳对高血压影响的研究[J]. 营养学报, 2005, 27(3): 253-255.

[12] PAN Daodong, LUO Yongkang, TANOKURA M. Antihypertensive peptides from skimmed milk hydrolysate digested by cell-free extract ofLactobacillus helveticusJCM1004[J]. Food Chemistry, 2005, 91(1): 123-129.

[13] 金锋. 微孔淀粉-海藻酸钠固定化木瓜蛋白酶的研究[J]. 中国酿造, 2009(7): 83-85

[14] 施安辉. 利用固定化细胞连续发酵生产酸牛奶[J]. 生物工程学报, 1995, 11(2): 203-204.

[15] 陈晔, 韩玉洁. 海藻酸钙法固定化乳酸菌发酵制备L-乳酸的研究[J].食品工业科技, 2008, 29(1): 98-101.

[16] 贺银凤, 午日娜, 王建华. 乳酸菌的固定化方法及其发酵特性的研究[J]. 食品研究与开发, 2006, 27(5): 16-18.

[17] 王树宁, 刘玺, 潘润淑, 等. 乳酸菌固定化技术研究[J]. 山西食品工业, 1998(1): 25-291.

[18] 赵春燕, 张颖, 王丹, 等. 乳酸菌细胞固定化发酵的研究进展[J]. 中国酿造, 2009(5): 11-14.

[19] CUSHMAN D W, CHEUNG H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971, 20(7): 1637-1648.

[20] 唐三三, 衣杰荣, 丁勇. 海藻酸钠法固定化酪氨酸酶的研究[J]. 湖南农业科学, 2009(6): 12-14.

Optimization of Conditions for Immobilization ofLactobacillus helveticusUsing Sodium Alginate

GUO Yu-xing1，PAN Dao-dong1,2,*，LIU Yang1，WANG Cui-cui1
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study,Lactobacillus helveticuswas immobilized using sodium alginate and used to product yogurt with ACE inhibitory activity. As determined using one-factor-at-a-time method in combination with an L9(34) orthogonal array design, the optimal immobilization conditions were sodium alginate concentration 1.5 g/100 mL, cell concentration 1:10 (m/V), CaCl2 concentration 0.1 mol/L, and immobilization time 1 h. The immobilized strain and traditional yogurt starter consisting ofLactobacillus bulgaricusandStreptococcus thermophiluswere used together to ferment 11 g/100 mL milk power solution at 37 ℃until coagulation was completed. Good coagulation was achieved after 8 h of fermentation. The pH of the yogurt obtained with a gentle and smooth taste was 4.2 and the ACE inhibitory activity 70.3%.

immobilization；sodium alginate；Lactobacillus helveticus；ACE inhibitingactivity

TS252.54

A

1002-6630(2012)05-0188-05

2011-06-29

国家自然科学基金青年科学基金项目(31101314)；江苏省自然科学基金项目(BK2011787)；江苏省教育厅高校自然科学基金项目(10KJB550003)；南京师范大学特聘教授、高层次人才科研启动基金项目(184070H2B08)

郭宇星(1981—)，女，讲师，博士，研究方向为乳品科学。E-mail：yuxingguo1981@yahoo.com.cn

*通信作者：潘道东(1964—)，男，教授，博士，研究方向为乳品科学。E-mail：daodongpan@163.com