浓香型白酒窖泥中高产己酸兼性厌氧细菌的分离鉴定

2012-10-25凌宏志平文祥赵志昌杨朝辉

食品科学 2012年5期

赵辉，敞颜，王葳，凌宏志，平文祥，赵志昌，杨朝辉

(1.黑龙江大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150080；2.农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150500；3.黑龙江省富裕老窖酒业有限公司，黑龙江富裕 161200)

赵辉1,2，敞颜1,2，王葳1,2，凌宏志1,2，平文祥1,2，赵志昌3，杨朝辉3

筛选及鉴定白酒窖泥中高产己酸的细菌，以应用于窖池保养及人工窖泥培养。从东北地区某酒厂优质窖泥中采用兼性厌氧培养及微量成分分析的方法，分离筛选出3株(C78、a57、A17)高产己酸的兼性厌氧细菌，其产己酸量分别为：213.6914、170.465、103.5097mg/100mL，经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定其分别为：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)及地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，相应最适pH值分别为7、6.5、7，最适温度分别为34、34、37℃，最适接种量分别为5%、5%、3%。

浓香型白酒；窖泥；产己酸细菌；鉴定

白酒是我国传统的发酵食品，因其独特的酿造工艺及其呈现的特殊风味，在世界酒类产品中别具一格。白酒种类繁多，分类各异。根据主体香成分的不同，可分为浓香型、酱香型、清香型、兼香型、凤香型、药香型和米香型等十几种香型。目前，浓香型白酒是白酒行业的主流，其产销量占白酒总产销量的70%[1]。在传统固态浓香型白酒发酵中，窖泥是白酒风味的基础，长期的工艺操作使窖泥富集了种类繁多、功能各异的益于酿酒的微生物菌群[2-9]。己酸菌是其中最重要的窖泥功能菌，其数量的多少以及其功能的强弱直接影响着浓香型大曲酒中特征风味物质的形成。己酸菌所产生的己酸在白酒中不仅起到呈香、助香、减少酒体刺激以及缓冲平衡的作用，而且还可以与乙醇发生酯化反应，生成浓香型大曲酒的主体香成分己酸乙酯，从而改善浓香型白酒的风味及口感。己酸产生细菌可应用于窖池保养以及人工窖泥培养等，可有效改善窖泥微生态环境，进而提高浓香型白酒的质量，对名优白酒生产的异地再现有着积极的意义[10-12]。

对产己酸菌的分离、筛选、分类、鉴定以及选育，是提高窖泥中己酸菌数量和质量的保证[13-16]。产己酸的细菌包括兼性厌氧和厌氧菌两大类，筛选兼性厌氧细菌可以降低己酸菌在窖泥使用过程中的应用成本，具有更高的应用价值。本实验采用非厌氧培养条件从优质窖泥中分离、纯化、筛选出高产己酸的兼性厌氧功能细菌，并进行生理生化及分子生物学鉴定，以期为使用人工窖泥扩大窖池内的优势菌群、改善窖内微生态环境、提高浓香型白酒质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与试剂

窖泥：取自某酒厂优质浓香型大曲酒发酵池。

分离和保藏培养基：5g乙酸钠、0.5g硫酸铵、0.4g磷酸氢二钾、0.2g硫酸镁、1g酵母膏、20mL乙醇(培养基灭菌后接种前加入)、5g碳酸钙、10mL 0.1%溴百里酚蓝指示剂、15～20g琼脂，加水至1000mL，调pH值为7.0，121℃灭菌20min。

发酵培养基：5g蛋白胨、5g牛肉膏、25g葡萄糖、5g NaCl，1000mL蒸馏水，pH7.0，121℃灭菌20min。

细菌基因组、质粒提取及DNA纯化回收试剂盒天根生化科技(北京)有限公司；正反向引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；pMD19-T载体、DNA聚合酶、DNA Marker、PCR产物克隆试剂盒宝生物工程(大连)有限公司；乙酸丁酯、乙酸、丁酸、己酸、丁酸乙酯、己酸乙酯为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CF16RXII 高速冷冻离心机日本日立公司；UV755B紫外分光光度计上海精密科学仪器有限公司；Tprofessional Thermocycler PCR仪德国Biometra公司；DNP-9082电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司；HZS-H水浴振荡器哈尔滨东联电子技术有限公司；GC7890气相色谱仪上海天美科学仪器有限公司；凝胶成像系统仪美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 高产己酸细菌的筛选

称取窖泥1g，放入盛有99mL无菌水且含有无菌玻璃珠的三角烧瓶中，用力振荡，使窖泥分散均匀，80℃水浴加热10min，淘汰非芽孢细菌，富集含芽孢优势细菌[17]。

吸取富集菌液1mL，将10-1～10-6梯度的稀释菌悬液分别涂布于筛选培养基(含有溴百里酚蓝指示剂)上，每个梯度做3个平行样，倒置于37℃恒温培养24h，筛选出黄色菌落，根据其菌落形态及显微形态的不同将其简单归类，并进行纯化保藏。

1.3.2 高产己酸细菌的复筛

分离纯化出的菌株活化后，分别接入发酵培养基中进行单菌种发酵。发酵结束后测定总酸、总酯含量，并对发酵液进行己酸的定性分析，对含己酸的发酵液再利用气相色谱法测定其己酸及重要香味成分的产量，复筛出高产己酸的功能细菌[18-20]。

1.3.3 菌株形态学观察及生理生化鉴定

筛选出的高产己酸细菌的形态学观察和生理生化鉴定方法参照《伯杰细菌鉴定手册》[21]和《常见细菌系统鉴定手册》[22]。生理生化鉴定包括氧对菌株的影响、接触酶实验、淀粉水解实验、葡萄糖氧化发酵产酸产气实验、甲基红实验(M.R.实验)、吲哚实验、明胶液化、石蕊牛奶实验、脲酶实验等生理生化实验，每个实验均重复3次且设有阴性和阳性对照[23-24]。

1.3.4 筛选菌株的16S rDNA鉴定

1.3.4.1 提取细菌基因组DNA

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取基因组DNA。

1.3.4.2 PCR扩增16S rDNA序列片段及克隆

以己酸产生细菌的基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增。引物序列如下：正向引物8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1512R：5′-ACGGCTACCT TGTTACGACTT-3′。PCR扩增反应体系为：10×PCR缓冲液 2.5μL，dNTP 2μL，正向引物与反向引物各1μL，DNA模板1μL，灭菌水17.3μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，总计25μL。

PCR扩增反应程序：94℃预变性10min；94℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，32个循环；72℃终延伸7min，4℃保存。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并使用DNA纯化回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化及回收。使用TaKaRa连接试剂盒，将纯化后的目的片段连接至pMD19-T 载体上，目的片段与载体连接反应体系如表1所示。混合均匀后，4℃静置过夜。连接结束后，转化E.coliDH5α感受态细胞，并进行蓝白筛选。

对重组阳性质粒保存并进行扩大培养，提取质粒，进行PCR检测，以验证克隆结果。

表1 PCR扩增产物纯化后的目的片段与载体连接反应体系Table 1 Coupled reaction system(10μL)

1.3.4.3 16S rDNA片段的测序与系统发育分析

序列测定由上海博亚生物技术有限公司进行。将测序所得到的16S rDNA全序列提交到GeneBank数据库，并应用Blast软件进行同源性搜索、比对分析，再应用DNAMAN软件构建系统发育树[25-26]。

1.3.5 筛选菌株培养条件的研究

设置发酵培养基的pH值梯度为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；培养温度的梯度为28、31、35、37、40℃；接种量的梯度为2%、3%、4%、5%、6%，将种子液接种于培养基中，置于恒温培养箱中培养，进行单因素试验。培养后梯度稀释涂平板，计算菌液浓度，重复3次，分别确定培养的最适pH值、温度和接种量。

1.3.6 指标检测方法

1.3.6.1 发酵液总酸、总酯产量的测定

总酸产量测定采用电位滴定法，总酯产量测定采用皂化法[25]。

1.3.6.2 己酸的定性分析

用移液管吸取1.5mL发酵液，缓慢沿壁滴加到含有5mL 20% CuSO4溶液的试管中，静置10min后观察CuSO4溶液中是否有蓝色絮状沉淀产生。若有，则说明发酵液中有己酸生成，否则说明没有[26]。

1.3.6.3 己酸等主要代谢产物测定

采用气相色谱法，用直径为0.22μm的过滤器对发酵液进行过滤，得到澄清透明溶液。以乙酸丁酯为内标，待测样品进样量为0.3μL。气相色谱法分析条件：用PEG2.0×107(聚乙二醇)毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，氢火焰离子检测器，柱温采取程序升温：初始温度为65℃，保持2min，然后以5℃/min的速率升温，升至 200℃时保持10min。进样器温度为260℃，检测器温度为260℃，载气(高纯氮气)流速：0.5～1.0mL/min，分流比20:1～100:1。

2 结果与分析

2.1 高产己酸细菌的分离筛选

通过筛选培养基筛选出黄色或黄绿色菌落为产酸菌。对其进行菌落形态描述和显微形态观察，共筛选出了18株不同的细菌，将产酸菌菌落进行纯化、保存，并对其进行产总酸、总酯产量分析、CuSO4显色法己酸定性分析和气相色谱分析。其中筛选得到的3株细菌，产总酸、总酯产量较高，结果如表2所示，CuSO4显色己酸定性分析表明皆含有己酸，在此基础上进一步进行气相色谱对酸、酯微量成分分析，结果见表3。

表2 发酵液中总酸、总酯产量Table 2 The contents of total acids and total esters in fermentation liquid

表3 发酵液中酸、酯微量成分气相色谱分析Table 3 Gas chromatographic analysis of fermentation liquid compositions

由表3可知，C78产己酸量最高，达到213.6914mg/ 100mL，a57次之，产量为170.465mg/100mL，A17己酸产量虽为103.5097mg/100mL，但A17发酵液中的乙酸、丁酸以及丁酸乙酯等酒体呈香、呈味物质的含量在18株菌株发酵液中均较高。综合考虑，以己酸产量为主、其他呈香、呈味物质为辅复筛出了3株高产己酸的优良功能菌株a57、A17、C78。

表4 细菌菌落形态及显微形态Table 4 Colonial and microscopic characteristics of the isolated strains

2.2 筛选菌株的鉴定

2.2.1 筛选菌株的形态学观察及生理生化鉴定

筛选出的3株高产己酸细菌a57、A17、C78菌落形态观察、显微形态观察如表4所示。生理生化实验结果如表5所示。初步确定菌株a57、A17、C78均为芽孢杆菌属(Bacillus cohn)。

表5 菌株生理生化特性Table 5 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strains

图1 16S rDNA PCR扩增产物电泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis for 16S rDNA PCR amplified products

利用细菌DNA提取试剂盒对菌株a57、A17、C78的培养液进行基因组DNA的提取。将提取基因组DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。凝胶成像系统可以看到单一、清晰且整齐的条带，表明所提取基因组DNA样品无降解、较完整。获得功能菌株a57、A17、C78基因组DNA后，用细菌通用引物对其进行16S rDNA PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，得到特异单一条带，结果如图1所示， a57、 A17、 C78与预计条带大小1600bp吻合。

将PCR扩增16S rDNA目的片段与pMD19-T Vector连接后，转化感受态细胞E.coliDH5α，进行蓝白筛选。用质粒提取试剂盒提取质粒并进行PCR扩增，其电泳结果如图2所示，目的片段转化成功，得到了阳性克隆。

将阳性克隆进行测序，菌株a57、A17、C78 16S rDNA测序结果在GeneBank数据库中利用Blast进行比对分

注：＋.阳性反应；－.阴性反应；－(+).不产气或弱产气。

2.2.2 菌株的16S rDNA鉴定及系统发育分析析，分析显示菌株a57与Bacillus fusiformisstrain Z1相似性最高，达99%，序列号为AY548950；菌株A17与Bacillus licheniformisstrain B8相似性最高，达99%，序列号为EU117278；菌株C18与Bacillus megateriumstrain SB3112相似性最高，达99%，序列号为GU191918。利用DNAMAN软件绘制菌株a57、A17、C78的系统发育树，结果如图3所示。结合菌落形态和生理生化分析，可以确定菌株a57为梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)，A17为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，C78为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。

图2 重组质粒PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of recombinant plasmids

图3 基于菌株a57(a)、A17(b)、C78(c) 16S rDNA基因的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain a57(a), A17(b) and C78(c) based on 16S rDNA gene sequence

2.3 筛选菌株培养条件的结果

图4 pH值(a)、温度(b)、接种量(c)对菌体浓度的影响Fig.4 Effect of pH (a), temperature (b) and inoculum size (c) on the concentration of bacteria

由图4a可知，A17和C78的最适pH值为7，a57的最适pH值为6.5；由图4b可知，a57和C78的最适温度为34℃，A17的最适温度为37℃；由图4c可知，A17最适接种量为3%，a57和C78的最适接种量为5%；此时相应培养的菌体浓度均达到最大。实际应用时，可在最适条件下进行单独或混合培养，在菌体浓度较高时，制成液体窖泥喷洒于浓香型酒窖的窖底和四壁，增加窖泥中己酸细菌的浓度，以促进白酒发酵生香；亦可单独或混合接种于酒窖外人工培养的固体窖泥，增加窖泥中产香功能菌的浓度。

3 结论与讨论

从某浓香型大曲酒厂优质窖泥中进行兼性厌氧己酸细菌的分离筛选，得到3株高产己酸的功能细菌A17、 a57及C78，经气相色谱法对其发酵液中己酸产量进行检测，产量分别为103.5097、170.465、213.6914mg/100mL。通过菌落形态、细胞显微形态观察、生理生化实验及分子生物学手段对菌株a57、A17及C78进行鉴定，其结果分别为：梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，并对其培养条件进行了初步研究，为高效人工窖泥的应用提供参考。

提高浓香型白酒的质量，需要适当地提高白酒中己酸乙酯的产量，也就要保证窖泥中己酸菌等功能菌的数量。在白酒生产中，窖泥使用一段时间后会老化，己酸菌等功能菌数量大量减少，严重影响着白酒的质量及优级品率。为防止窖泥老化、缩短新窖老熟时间，就需要进行窖泥养护和人工窖泥培养等方面的研究[27-28]。本实验采取非厌氧培养的方法分离得到了3株高产己酸的兼性厌氧细菌，与厌氧己酸细菌Clostridium kluyverii相比[29]，更易于实现窖外窖泥的养护和人工窖泥的培养，可提高窖泥培养效果，节约培养成本，并且Bacillus fusiformis、Bacillus licheniformis和Bacillus megaterium已广泛作为酶及食品添加剂工业的发酵菌种，具有较高的生物安全性。

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Isolation and Identification of Facultative Anaerobic Strains with High Yield of Hexanoic Acid from Luzhou-flavor Liquor Pit Mud

ZHAO Hui1,2，CHANG Yan1,2，WANG Wei1,2，LING Hong-zhi1,2，PING Wen-xiang1,2，ZHAO Zhi-chang3，YANG Zhao-hui3
(1. College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China；2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Harbin 150500, China；3. Heilongjiang Fuyulaojiao Brewery Co. Ltd., Fuyu 161200, China)

In order to screen and identify hexanoic acid-producing anaerobic bacteria with high yield from liquor pit mud and to apply it in maintaining pits or artificial pit mud. The hexanoic acid-producing anaerobic strains with high yield were isolated and selected from the fine pit mud of the distillery in the northeast area by facultative anaerobic culture and trace component analysis. The yields of hexanoic acid were up to 213.6914, 170.465 mg/100 mL and 103.5097 mg/100 mL, respectively. The species identification showed that three strains wereBacillus fusiformis,Bacillus licheniformis andBacillus megaterium, respectively, through morphological observation, physiological and biochemical tests and molecular biology methods. The optimal pH was 7, 6.5 and 7 and the optimal temperatures were 34, 34 ℃ and 37 ℃ as well as the optimal inoculums were 5%, 5% and 3%. This study provides a theatrical guidance for the application of efficiently artificial pit mud.

Luzhou-flavor liquor；pit mud；hexanoic acid-producing bacteria；identification

Q815

1002-6630(2012)05-0177-06

2011-09-28

哈尔滨市科技局科技创新人才专项基金项目(2011RFQXN056)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511409)

赵辉(1971—)，男，副教授，博士后，研究方向为发酵工程。E-mail：zhaohui9463@sohu.com