乌贼墨多糖缓解环磷酰胺致大鼠骨髓功能抑制作用的研究

王 光，钟杰平，刘华忠

(1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088;2.广东海洋大学理学院，广东湛江 524088;3.广东海洋大学生物化学中心，广东湛江 524088)

乌贼墨多糖缓解环磷酰胺致大鼠骨髓功能抑制作用的研究

王 光1，钟杰平2，刘华忠3，*

(1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088;2.广东海洋大学理学院，广东湛江 524088;3.广东海洋大学生物化学中心，广东湛江 524088)

探讨乌贼墨多糖(SIPS)对环磷酰胺所致骨髓功能抑制的缓解效应。以SD大鼠为模型，灌服SIPS和腹腔注射环磷酰胺共处理，检测大鼠外周血像和骨髓DNA含量。环磷酰胺不仅显著降低了大鼠外周血红细胞、白细胞和血小板的数量以及血红蛋白的含量，骨髓细胞DNA含量也被显著下调(p＜0.01 or p＜0.05)。SIPS十分明显的弱化了该化疗药物的骨髓抑制功能，环磷酰胺对以上指标参数所导致的负效应均被该海洋活性物质不同程度的消减(p＜0.05 or p＜0.01)。SIPS可缓解环磷酰胺所致大鼠骨髓造血功能抑制作用。

乌贼墨多糖，环磷酰胺，骨髓抑制，大鼠

当前尽管已有多种肿瘤治疗措施被相继创立，但临床上化疗依然是最常采用的治疗手段，环磷酰胺(cyclophosphamide，CP)就是其中一种广泛被使用的抗肿瘤药物。作为一种氮芥类抗肿瘤药物，CP在肝脏微粒体细胞色素P－450酶系代谢活化［1］。研究表明，高剂量CP通过损伤细胞的结构与功能而诱导免疫抑制［1］、心脏毒性［2］、肺毒性［3］和骨髓功能抑制［4］等，因此，因其细胞毒性而导致化疗药物的临床应用受到了限制，结果使得癌症治疗效果显著下降。因而，用于肿瘤临床化疗上的细胞保护剂的筛选与应用迫在眉睫。多糖已被广泛认为是一类多功能的

生物活性物质，天然多糖根据来源不同可分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖。目前，大约300多种天然多糖已被分离鉴定，其中大部分被证实具有生物学活性。随着海洋生物技术的发展以及对海洋天然活性物质的研究的增多，源自海洋生物的多糖正成为科学界的研究热点。这其中，乌贼墨多糖(squid ink polysaccharides，SIPS)是近年来新发现的一种海洋多糖，分离于乌贼墨汁。大量的研究结果证实，乌贼墨不仅具有抗肿瘤［5］、抗氧化［6］、抗菌［7－8］、升白［9］等生物学活性，而且能保护小鼠骨髓和脾脏，弱化环磷酰胺对造血功能造成的损伤［4］。虽然先前的研究发现，乌贼墨对CP所致正常组织器官的毒性损伤具有缓解效应［3－4，10］，但因为乌贼墨是一种混合物，包含有色素、蛋白、脂类和多糖等。为筛选其化疗保护有效成分，本研究制备了SIPS，并和环磷酰胺共刺激大鼠，以大鼠的骨髓功能为评价指标，确证SIPS的化疗保护功效。

1 材料与方法

1.1 SIPS的制备

SIPS 的制备方法参考先前的报道［11－12］。

1.2 实验设计

体重相近(155±10)g的10周龄健康SD大鼠适应性驯养1周后开始接受实验处理。动物房温度为(26±2)℃，相对湿度为44%～45%，光暗周期为10h与14h。动物随机均分为8组，10只/组，雌雄各半。对照组(A)全实验期(15d)灌服生理盐水，于第6d和7d腹腔注射生理盐水两次;模型组(B)分别于实验第6d和7d两次腹腔注射CP(100mg/kg，溶于生理盐水)，全程灌服生理盐水;C、D组为SIPS和CP共处理组，该两组大鼠全程分别灌服SIPS，剂量分别为60、120mg/kg(1次/d)，并且于第6、7d腹腔注射腹腔注射CP。整个实验期为15d，第16d处死大鼠，进行实验指标检测。

1.3 外周血像检测

大鼠摘眼球取血，抗凝，血细胞自动分析仪检测红细胞、白细胞和血小板数量，以及血红蛋白含量。

1.4 骨髓DNA含量检测［4］

剥离小鼠左侧后肢股骨，用眼科手术剪将股骨两端剪断，露出骨髓腔。用10mL 0.005mol/L CaCl2冲洗骨髓至离心管中，4℃冰箱放置30min，2500r/min离心15min。弃上清，加入0.2mol/L HClO4溶液5mL，振荡混匀后，90℃加热15min。快速冷却至室温，冷却后过滤，紫外分光光度计测定268nm的吸光度值。

1.5 数据处理

数据以均数±标准差(¯X±S)表示，数据分析采用SPSS 17.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 外周血像

数据结果详见图1。相较于空白对照组，CP(100mg/kg)处理导致了大鼠外周血中红细胞、白细胞和血小板数量以及血红蛋白含量显著下降(p＜0.01)。然而在SIPS和CP共处理组中，这四个参数却出现了比模型组明显的不同程度的提升，白细胞和血小板数量均显著高于模型组(p＜0.05或p＜0.01)，对于红细胞和血红蛋白，明显的变化见于SIPS 120mg/kg剂量组(p＜0.05)。

2.2 骨髓DNA含量

为进一步探讨SIPS对CP诱导的骨髓功能抑制的作用效果，本实验检测了骨髓细胞DNA含量，数据详见图2。结果显示，尽管CP显著下调了大鼠骨髓细胞DNA含量(p＜0.01)，但该下降趋势却被SIPS所抑制，其最终锚定的数据值明显高于CP单独处理的模型组大鼠(p＜0.05)。结果表明，SIPS能明显改善CP对大鼠骨髓DNA的损伤，抑制骨髓有核细胞的减少，缓解CP对骨髓造血功能的毒性损伤。

3 讨论

图1 SIPS对环磷酰胺致大鼠外周血像变化的影响(n=10)Fig.1 Effect of SIPS on peripheral blood profile changes induced by CP in rats(n=10)

图2 SIPS对环磷酰胺致大鼠骨髓细胞DNA含量变化的影响(n=10)Fig.2 Effect of SIPS on CP－indeced changes of DNA content in bone marrow from rats(n=10)

骨髓是人体最大的造血器官。造血干细胞是生成各种血细胞的原始细胞，具有很强的分裂增殖潜能，其在一定的微环境和某些因素的调节下增殖分化为各类血细胞的造血祖细胞。血细胞发生是造血干细胞经增殖、分化直至成为各种成熟血细胞的过程。当机体受到某些外部因素的攻击，如化疗和放射，造血干细胞和造血祖细胞的增殖均将受到严重抑制。环磷酰胺是一种被临床上广泛使用的抗肿瘤药物，其作用靶标为细胞快速分裂增殖组织或器官，因而，除兼备不死性、转移性和无接触抑制性等特征的肿瘤细胞之外，尤其是对增殖活跃的骨髓造血干细胞作用特别强，主要破坏细胞DNA的结构和功能，从而影响骨髓造血干细胞的增殖、分化并抑制骨髓造血功能。

环磷酰胺诱导线粒体发生氧化应激，产生活性氧(ROS)，启动下游多种反应程序，导致氧化—抗氧化平衡向氧化方向倾斜，损伤生物高分子(如DNA、蛋白质)，导致细胞凋亡［13］。本实验结果发现，环磷酰胺显著下调了外周血红细胞、白细胞和血小板数量以及血红蛋白和骨髓DNA含量，表明环磷酰胺所致大鼠骨髓损伤模型构建成功。

SIPS为从乌贼墨中分离制备的多糖，背景研究已经揭示SIPS分子为带有分支结构的糖胺聚糖，主链为葡萄糖醛酸—海藻糖(GlcA－Fuc)二糖单元的串联重复，N－乙酰半乳糖胺(GalNAc)分支于海藻糖，完整的三糖重复单元为{－3GlcAβ1－4(GalNAcα1－3)Fucα1－}n［14－15］。本研究结果发现，SIPS 能显著改善环磷酰胺对大鼠外周血像和骨髓DNA含量造成的负面影响，本文所示两个剂量组中，高剂量组的保护效果明显优于低剂量组，而且，与本课题组前期报道的180mg/kg 的最高剂量组比较［16］，120mg/kg 剂量依然稍强，因此，在我们所做的60、120、180mg/kg三个剂量组中，120mg/kg为最适宜剂量。结果表明，SIPS能显著缓解环磷酰胺对大鼠骨髓造血功能所造成的抑制作用。

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Study on squid ink polysaccharides weakens the suppression of bone marrow induced by cyclophosphamide in rats

WANG Guang1，ZHONG Jie－ping2，LIU Hua－zhong3，*
(1.College of Food Science ＆ Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;2.College of Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;3.Modern Biochemistry Center，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

In orderto explore the amelioratory effects ofsquid ink polysaccharides(SIPS)towards cyclophosphamide－induced suppression of bone marrow functions.Sprague－Dawley rats were employed to be co－treated with intraperitoneal cyclophosphamide and oral SIPS.Peripheral blood profile and DNA content in bone marrow were detected.Cyclophosphamide decreased significantly the quantities of erythrocytes，leukocytes and platelets in blood，contents of hemoglobin in blood and DNA in bone marrow(p ＜0.01 or p ＜0.05).SIPS incoordinately impaired the negative changes induced by cyclophosphamide(p＜0.05 or p＜0.01).It was implied that SIPS could protect bone marrow from chemotherapeutical damage caused by cyclophosphamide.

squid ink polysaccharides;cyclophosphamide;suppression of bone marrow;rats

TS254.9

A

1002－0306(2012)17－0365－03

2012－01－12 *通讯联系人

王光(1983－)，男，硕士研究生，主要从事海洋生物活性物质研究。

国家自然科学基金(31171667)。