功能食品中番茄红素的高效液相色谱检测方法

罗琥捷，区海燕，杨宜婷

(无限极(中国)有限公司，广东广州 510665)

功能食品中番茄红素的高效液相色谱检测方法

罗琥捷，区海燕，杨宜婷

(无限极(中国)有限公司，广东广州 510665)

建立了一种广泛适用于功能食品的测定番茄红素含量的高效液相色谱检测方法。样品前处理采用水油两相萃取方法;色谱条件为色谱柱 Inertsil ODS－SP 柱(5μm，4.6 ×250mm)，流动相为乙腈∶甲醇 =1∶1，流速为 1.2mL/min，检测波长为472nm。分析结果表明，番茄红素在0.30～50.0μg/mL线性良好，相关系数R2=0.9998，加标回收率98.6%，RSD为3.0%，说明该方法准确可靠。

高效液相色谱法(HPLC)，番茄红素，检测

番茄红素(Lycopene)是β－类胡萝卜素的一种。目前研究发现，其具有抗氧化、清除自由基、促进细胞间的连接和传导、防癌抗癌等多种生理功能。作为一种功能性的天然色素，番茄红素被认为可以广泛利用在功能性食品和医药(原料)中［1］。功能食品的剂型很多，从形态上主要分成固体制剂和液体制剂。功能食品根据剂型的不同而选择不同的番茄红素原料，例如片剂和硬胶囊的固体制剂会选用固体的番茄红素原料。由于番茄红素的稳定性差，固体番茄红素原料多为微囊化包埋，而不同公司的微囊化包埋操作不一样，这给番茄红素含量的检测带来困难。GB/T 22249－2008［2］在针对某些国内外微囊化包埋的番茄红素的检测就遇到了困难，前人的研究［3－4］也多围绕番茄、番茄提取物等未经微囊化包埋处理的物料进行，这给现实的检测工作带来了不便。本实验建立了一种适用于含微囊化包埋处理的番茄红素的功能食品的含量检测方法，而且该方法也适用于市面上常见的油状的含番茄红素的功能食品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

番茄红素包埋粒 购于健永生技、DSM、华北制药、浙江新昌等公司;含番茄红素的固体功能食品自制(以下方法学研究，如无特殊交代，均选用了健永生技公司的番茄红素);市售番茄红素功能食品(GNC、枫之宝、家得路);番茄红素标准品 购于Sigma公司，纯度95%以上;二氯甲烷、丙酮、石油醚、焦性没食子酸、2，6－二叔丁基对甲酚(BHT)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾均为分析纯;乙腈、乙酸乙酯为色谱纯;水为超纯水。

1200型高效液相色谱仪 安捷伦公司;AL204型电子天平梅特勒－托利多公司;AS10200BDT超声波清洗器 天津奥特赛恩斯公司;XW－80A旋涡混合器 北京维欣仪器公司。

1.2 色谱条件［2］

流动相:乙腈∶甲醇 =1∶1;流速:1.2mL/min;色谱柱:Inertsil ODS－SP柱(5μm，4.6×250mm);检测波长:472nm，柱温:室温;进样量10μL。

1.3 试液的配制(临用新配制)［2］

0.1%BHT二氯甲烷溶液的配制:取0.50g BHT加入二氯甲烷500mL溶解，混匀。

0.1%BHT丙酮溶液的配制:取0.25g BHT加入丙酮250mL溶解，混匀。

磷酸盐溶液的配制:取磷酸氢二钠11.49g、磷酸二氢钾0.41g，加水200mL，超声溶解，混匀。

焦性没食子酸磷酸盐溶液的制备:取焦性没食子酸适量，加以上磷酸盐溶液制成每1mL约含1mg的溶液，即得。

1.4 对照品溶液的制备(临用新配制)

对照品储备溶液的制备:精密称取0.01g番茄红素对照品，加二氯甲烷约5mL超声至完全溶解，冷却，用0.1%BHT丙酮溶液定容至50mL。配制成浓度为200μg/mL的番茄红素对照品储备溶液。

对照品校准溶液的标定:吸取对照品储备溶液0.1mL(V1)用石油醚定容至10mL(V2)，采用紫外/可见分光光度计，1cm比色皿，波长472nm测量对照品溶液吸光度值，石油醚作空白。按照下式计算对照品溶液番茄红素的浓度CST(μg/mL)。

式中:A:对照品在472nm处的吸光系数;104:1g/100mL转化为 1μg/mL的转换因子;3450:1g/100mL番茄红素在石油醚中的理论吸光系数。

标准工作溶液的制备:精密吸取该对照品储备溶液 0.125、0.25、0.50、1.00、2.50mL 分别置 10mL 量瓶中，加入含0.1%BHT丙酮溶液稀释至刻度，摇匀。

1.5 供试品溶液的制备

供试品溶液的制备:取4g样品，混合均匀，取约0.38g，精密称定，置250mL棕色容量瓶中，加入焦性没食子酸磷酸盐溶液70mL，再加入BHT二氯甲烷溶液100mL，涡旋混合2min，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，旋涡混匀，静置5min，目测瓶底无明显红色番茄红素细微颗粒(若有颗粒可加入8mL甲苯再超声 30min)，旋涡混匀 3～5min，离心(5500r/min)5min，分取二氯甲烷液，水液依次再加入BHT二氯甲烷溶液80、60mL，旋涡混旋均匀，离心分取二氯甲烷液，合并三次二氯甲烷液，加入BHT二氯甲烷溶液定容至250mL，摇匀，吸取此溶液2.00mL用0.1%BHT丙酮定容至10mL，即得。

1.6 线性关系考察

精密吸取对照品贮备溶液 0.125、0.25、0.50、1.00、2.50mL分别置10mL量瓶中，加入含0.1%BHT丙酮溶液稀释至刻度，摇匀，得浓度分别含番茄红素2.5、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL 系列溶液;再分别精密吸取10.0μg/mL标准溶液0.30、1.25mL置10mL量瓶中，加入含0.1%BHT丙酮溶液稀释至刻度，摇匀，得浓度分别含番茄红素0.300、1.25μg/mL溶液。把上述7种标准溶液分别进样测定峰面积响应值(10.0μL进样)，分别以浓度 C(μg/mL)为横坐标和峰面积响应值A为纵坐标，得回归方程(Y为浓度值，X为峰面积)。

1.7 精密度实验

1.7.1 仪器精密度 取浓度为2.2μg/mL的番茄红素对照品溶液一份，连续进样6次，计算平均值和相对标准偏差RSD。

1.7.2 重复性实验 取含番茄红素的样品6份，按1.5方法处理，精密吸取供试品溶液各10.0μL，注入液相色谱仪测定，计算平均值和相对标准偏差RSD。

1.7.3 重现性实验 取含番茄红素的样品，由3名操作人员分别在2d内分别进行测定，实验操作按1.5方法进行，精密吸取供试品溶液各10.0μL，注入液相色谱仪测定，计算平均值和相对标准偏差RSD。

1.8 稳定性实验

取含番茄红素的供试品溶液一份，测试开始，每隔1h，连续测定3次，然后每隔2h，连续测定3次，计算平均值和相对标准偏差RSD。

1.9 加标回收率的测定方法

转身帮泥巴扣好了带子。左小龙开着摩托车载着她走。当时是春天。是春天的中旬，是一个独立的气候。阳光洒满，云朵从云朵里穿透过来，空中的风就像是裙子撩动的气流，左小龙默默的载着泥巴到了一个垃圾站前。他把泥巴放下车，摘掉自己的头盔，再取下泥巴的头盔，问：“你是不是言情小说看多了？”

把含番茄红素样品重复性实验的检测结果作为本底值，取该番茄红素样品适量，分0.8、1.0、1.2倍三个浓度水平加入一定量的对照品，按1.5方法处理及测定，计算回收率、平均回收率和相对标准偏差RSD。

1.10 检测限与定量限的确定

根据方法学要求，以3倍信噪比作为仪器检测限，10倍信噪比作为仪器定量限。

1.11 测量范围考察取含番茄红素样品，称取不同的样品量，按1.5方法处理样品，并使其测定浓度在线性范围的低、中、较高、高处，以验证该方法测定不同番茄红素含量的样品的准确性，计算平均值和相对标准偏差RSD。

1.12 样品测定

1.12.1 其它固体功能食品 选用其它公司的番茄红素包埋粒自制功能食品，按1.5方法处理样品并进行含量检测，计算相对标准偏差RSD。

1.12.2 市售番茄红素功能食品 上市的含番茄红素的功能食品中软胶囊非常普遍，购买三款产品验证该番茄红素检测方法的适用性。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

2.2 系统适用性

在确定的色谱条件下，番茄红素保留时间分别为:12.83min，对称因子为0.81，符合要求;理论塔板数以半峰宽法计算，为10141，符合要求。见图1。

图1 番茄红素对照品色谱图(上图)和光谱图(下图)Fig.1 HPLC chromatogram(up)and spectrum(down of lycopene standards

表1 精密度实验结果Table 1 Results of the precision test

表3 重现性实验结果Table 3 Results of the reproducibility test

表4 稳定性实验结果Table 4 Results of the stability test

2.3 标准曲线的确立

结果如图2所示。实验说明:标准浓度在0.30～50.0μg/mL 线性良好，R2=0.9998。

图2 番茄红素标准曲线Fig.2 Standard curve of lycopene

2.4 精密度分析

2.4.1 仪器精密度分析 结果见表1。由表1可见，RSD为2.1%，说明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性分析 结果见表2。由表2可见，RSD为0.4%，说明方法重复性实验符合方法学要求。

表2 重复性实验结果Table 2 Results of the repeatability test

2.4.3 重现性分析 结果见表3。由表3可见，RSD为0.7%，实验说明该方法的重现性好。

2.5 稳定性分析

结果见表4。由表4可见，测定溶液在8h内是稳定的。

2.6 加标回收率结果分析

结果见表5。由表5可见，该方法条件下，加标回收测定结果好，平均回收率98.6%，而RSD仅为3.0%。因此，该色谱分析方法结果准确可靠。

表5 回收率实验结果Table 5 Results of the recovery test

2.7 检测限与定量限的分析

一般情况下，以3倍信噪比作为仪器检测限，10倍信噪比作为仪器定量限，按照本实验的仪器色谱条件，0.10μg/mL信噪比为3.8≥3，作为仪器检测限，0.30μg/mL信噪比为11.8≥10，作为仪器定量限。

2.8 测量范围的分析

结果如表6所示。由表6可见，该方法条件下，样品测定结果的重复性好，相对偏差RSD为0.6%，说明该方法适用于不同浓度的番茄红素含量的样品。

表6 测定范围实验结果Table 6 Results of the measuring range test

2.9 样品的测定

2.9.1 不同番茄红素包埋粒的自制食品的测定 结果如表7所示。

由表7可见，该方法适用于多种番茄红素包埋粒做成的固体功能食品。目前，市面上越来越多厂家销售番茄红素包埋粒，其各自采用不同的水溶乳化体系进行微囊化包埋生产。而本次实验所用到的国内外四家公司的番茄红素包埋粒其水溶性不尽相同，有的水溶，有的水难溶，所以该检测方法对番茄红素包埋粒适用范围广。

表7 其它样品测定结果Table 7 Results of other samples

2.9.2 市售番茄红素功能食品的测定 结果如表8所示。

由表8可见，该方法适用于多家市售番茄红素的产品。番茄红素软胶囊内容物基本上是以植物油为稳定剂，再辅以功效成分而制成。在检测前处理阶段，主要是要充分萃取番茄红素。该方法的前处理操作中既有水溶媒又有有机溶媒，这对处理难溶于水的番茄红素而言就较为容易。所以可以推测该检测方法适用于番茄红素软胶囊。

3 结论

虽然目前番茄红素功能食品主要以软胶囊为主，但是随着番茄红素包埋粒的推广及普及，番茄红素功能食品会越来越多出现固体制剂形式。本实验建立了一种广谱的用HPLC方法测定方法。该方法选择适宜的水油萃取体系、检测波长、色谱柱温、等度洗脱等参数，较好地实现了番茄红素的分离，平均回收率达到98.6%，RSD为3.0%，说明该方法实用、准确可靠、重现性好。

表8 其它样品测定结果Table 8 Results of other samples

［1］刘立国，吴晶.番茄红素及生产应用研究［J］.食品工业科技，2002，23(4):74－75.

［2］杨大进，鲁杰，王竹天，等.GB/T 22249－2008保健食品中番茄红素的测定［S］.北京:中国标准出版社，2008.

［3］张志强，江英.番茄红素的HPLC检测方法的研究［J］.四川食品与发酵，2006，42(6):44－46.

［4］郭戎，包贝华，邵霞，等.HPLC法测定番茄红素提取物中番茄红素的含量［J］.江苏科技信息，2010(12):32－33.

Determination on lycopene in functional foods by the high performance liquid chromatographic method

LUO Hu－jie，OU Hai－yan，YANG Yi－ting
(Infinitus(China)Company Ltd.，Guangzhou 510665，China)

The content of lycopene in functional foodswas determined bythe high performance liquid chromatographic method(HPLC).The sample pre－treatment method was by use of water－oil two－phase extraction methods.Separation was achieved by the use of Inertsil ODS－SP column(5μm，4.6 × 250mm)，acetonitrile∶methanol(1∶1)as mobile phase，a flow rate of 1.2mL/min and detector at 472nm was used.Lycopene showed good linear relationship between the range of 0.30 and 50.0μg/mL(R2=0.9998);and the average recovery was 98.6%with RSD=3.0%.The results showed that the method was accurate.

high performance liquid chromatographic method(HPLC);lycopene;determination

TS207.3

A

1002－0306(2012)17－0299－04

2012－02－01

罗琥捷(1979－)，男，硕士，工程师，主要从事功能食品的开发研究。