6种中药提取物消除大肠杆菌耐药性的研究

张传津 都业良 彭媛芳 高迎春（①山东省兽药质量检验所 山东 济南 250022 青岛农业大学 山东 青岛）



6种中药提取物消除大肠杆菌耐药性的研究

张传津①都业良②彭媛芳②高迎春①*（①山东省兽药质量检验所 山东 济南 250022 ②青岛农业大学 山东 青岛）

通过对15株致病性大肠杆菌耐药谱的调查，采用浓度为1000mg/L的地锦草提取物、黄芩苷提取物、苍术油、连翘提取物、雪胆提取物和十大功劳提取物对大肠杆菌作用20h，观察作用前后大肠杆菌对6种抗生素的耐药率的变化。耐药谱调查结果显示，10耐及10耐以上的大肠杆菌达80%。经不同中药提取液作用后，地锦草提取液具有比较好的耐药性恢复作用，十大功劳、黄芩和雪胆提取物的效果次之，而苍术油和连翘提取液并无恢复耐药性的作用。说明部分中药可恢复耐药性大肠杆菌对抗生素药物的耐药性。

中药提取物 大肠杆菌 耐药性 地锦草

由于抗生素的不合理使用，细菌的耐药现象在全球范围内迅速蔓延，耐药性的产生使治疗细菌感染成为了严重困扰动物健康的问题。因此，人们千方百计地从不同途径寻求克服细菌耐药性的新方法[1]。20世纪80年代，中草药和天然植物部分或全部恢复其对抗生素的敏感性成为当今人们关注的焦点，为解决耐药性问题提供了一条新途径[2]。本文对地锦草提取物、黄芩提取物等6种中药提取物的细菌耐药性逆转情况进行了探索，为耐药抑制剂的研发提供理论和数据支持。

1 材料

1.1 试验器械

平皿、酒精灯、锥形瓶、玻璃棒、PH试纸、小试管、高压锅、电炉、电子天平、超净台、眼科镊、酒精灯、接种针、培养箱、灭菌棉签、冰箱、卡尺。

1.2 药敏纸片

强力霉素、阿莫西林、头孢氨苄、氧氟沙星、氨苄青霉素、庆大霉素、新霉素、环丙沙星、左氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氟哌酸。均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 试验试剂

MH琼脂培养基、麦康凯培养基、营养肉汤，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.4 试验菌株

来自临床禽源和猪源的15株已经过鉴定的大肠杆菌，由山东省动物疫病防控中心提供。

1.5 中药提取物

采用水提和醇提等方法共得到6种中药提取物，分别是：地锦草提取物、黄芩苷提取物、苍术油、连翘提取物、雪胆提取物和十大功劳提取物，并浓缩至每1ml含生药1g，流通蒸汽灭菌后低温保存备用。

2 方法

2.1 细菌耐药谱的调查

2.1.1 制备接种菌液 选择琼脂平板上形态相似的菌落4~5个，用接种环挑其顶部，移至4~5ml营养肉汤。35℃培养至菌液浓度为0.5麦氏浓度，约1~2×108cfu/ml。

2.1.2 制备MH琼脂 琼脂厚度为4mm，约25~30ml。当日使用或者放于2~8℃冰箱保持，保存时间不得超过7d。其pH为7.2~7.4。

2.1.3 接种平板 校正的菌液在15min内使用。用灭菌棉签蘸取菌液，在试管壁上挤压除去多余液体，在固体培养基上均匀涂布，盖好平皿，在室温中放置5min，待平皿表面稍干后再放含药纸片。

2.1.4 贴纸片 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴在涂有细菌的培养基表面，均匀地贴在平皿离边缘15mm处，纸片间的距离应超过24mm。贴纸片时可轻压，以保证与培养基密切接触，纸片贴上后不可以再移动，因为抗菌素会自动扩散到培养基内。

2.1.5 培养 平板35℃倒置培养16~18h。

2.1.6 观察结果 观察含药纸片周围有无抑菌环，并量其直径(包括纸片直径)大小，用毫米为单位记录。

2.1.7 结果解释 参考最新2009年1月份的K-B标准与杭州天和微生物试剂有限公司提供的部分标准。

2.2 中药提取物的耐药性恢复试验

2.2.1 中药最低抑菌浓度测定 将各种中药稀释成终浓度为1000mg/ml的药液。采用试管二倍稀释法对试验菌株进行MIC试验。即取12支无菌试管编号，1~11号无菌试管各加入1×106CFU/ml菌液1ml，取1ml原药液置于第1号试管中，均匀混合，继而吸取1ml加入2号试管内，依次类推稀释至10号管，弃去1ml，第11号管作为不加中草药液的菌液对照管，第12号管只加药液1ml作为不加菌悬液的中草药液对照管。摇匀后置于37℃的恒温箱中培养18h后观察结果。

2.2.2 逆转耐药大肠杆菌的效果测定 用营养肉汤分别将6种中药提取液稀释为低于MIC的药液。分别挑取耐药性大肠杆菌于各药液中，分别培养20h后，用无菌棉签沾取菌悬液涂布于M-H固体平板，根据抗生素的分类，选择具有代表性的新霉素、氧氟沙星、头孢氨苄、环丙沙星、阿莫西林和强力霉素6种药敏纸片做药敏试验。同时用无中药肉汤培养基平行培养相同菌株作为对照。采用改良Kirby-Baller法[2]，按美国国立临床实验室标准化委员会2009年版的规定标准判读结果。

3 结果

3.1 耐药谱调查结果

结果显示，15株致病性大肠杆菌对12种常用的抗菌药物均有不同程度的耐药。这些菌株中7耐、8耐和9耐各1株。绝大部分菌株都耐10种及10种以上的药物，共有12株，占所有菌数的80% ，其中10耐的7株、11耐的1株、12耐的4株。

3.2 耐药性恢复试验结果

3.2.1 最低抑菌浓度测定结果 通过MIC法，结果发现在最高浓度下，6种提取物稀释液都有细菌增殖，说明5种中药MIC都大于1000mg/ml。

3.2.2 中药逆转耐药菌效果测定 结果详见表1。通过试验发现，6种中药提取液对大肠杆菌感触培养后，耐药率有不同程度的下降。地锦草提取液相对于其他中药提取物具有较好的耐药恢复作用。地锦草作用后，细菌对新霉素、氧氟沙星、头孢氨苄和强力霉素的耐药率都下降了6.67%。十大功劳、黄芩苷和雪胆提取物的效果次之。十大功劳作用后，细菌对新霉素和氧氟沙星的耐药率都下降了6.67%。黄芩苷作用后，细菌对氧氟沙星的耐药率下降6.67%，雪胆提取物作用后，细菌对强力霉素的耐药率下降6.67%。而苍术油和连翘提取液并无恢复耐药性的作用。但所有中药提取液都对环丙沙星和阿莫西林的耐药性没有恢复作用。

表1 六种中药提取物逆转耐药性的结果

4 讨论

监测细菌的耐药现状和变化趋势，进而研究耐药性的产生机制并对耐药性加以控制或消除，对临床上更合理地用药控制细菌性感染疾病的流行，生产安全的畜禽产品具有重要的现实和理论意义。本次试验中的15株菌株中对目前常用的抗菌药物均全部耐药，而10耐及10耐以上的“超级菌”达80%。表明本次所用的大肠杆菌对抗菌药的耐药已相当严重，耐药率普遍较高，多重耐药也相当严重。细菌耐药性的形成有多方面的因素，有细菌本身固有的因素，更多的则是细菌在强大的抗生素选择压力下，逐步形成了能够稳定遗传的耐药特性。一个菌株可以同时具有多种耐药机制，对一种抗生素的耐药性也可以由不同的耐药机制产生。因此，在临床上应该加强细菌耐药性监测，正确使用抗生素，同时加大对耐药性抑制剂的研究。只有这样才能有效控制耐药菌的蔓延，减少耐药菌带来的危害，促进畜牧业的健康发展。

降低细菌耐药性使其部分或全部恢复对抗生素的敏感性，对于临床治疗细菌感染具有重要意义。虽然很多试验证明苍术、金银花、黄芩、黄连、黄柏、败酱草、鱼腥草、紫草等通过消除R质粒的方式来起到恢复耐药性的作用[3]，但不同研究者对同种药物和同种细菌的研究结果也存在较大的差异[4~6]，重复性较差。目前，中药质粒消除作用的具体成分及作用的机制还不清楚。通过本次试验的中药逆转耐药菌效果可知，6种中药恢复耐药性的效果以地锦草提取物为最佳，其次是十大功劳、黄芩和雪胆提取物，无效果的是苍术油和连翘提取物。

地锦草为一年生草本大戟科植物，全草含黄酮类、没食子酸、内消旋肌醇。中医的作用主要是清热解毒，活血，止血，利湿，通乳。也有治菌痢，肠炎，咳血，吐血，便血，崩漏，外伤出血等功效。由于地锦草的作用最好，建议继续针对地锦草进行中药提取和耐药性恢复试验。进一步的改进工艺，对中药的提取成分进行细化分析，针对性的进行抑制细菌耐药性的制剂的工艺研究，将有利于生产的提取和研发。

[1] Emine Kucukates.Antimicrobial resistance among Gram-negative bacteria isolated from intensive care units in a Cardiology Institute in Istanbul, Turkey[J]. Jap J Infect Dis, 2005, 58(4): 228-231.

[2] 刘克, 关键, 李菁华等. 黄芩甙对铜绿假单胞菌R质粒的消除作用[J].微生物学杂志, 2003, 23(2): 49-56.

[3] 蒋培余. 中药抑制剂逆转细菌耐药性的研究进展[J]. 辽宁中医药大学报, 2008(10): 53-55.

[4] 于军, 于红, 肖洋等. 射干提取液对铜绿假单胞菌PA11株R质粒体内外消除作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2003, 29(2): 170-171.

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（2012–03–31）

国家十一五科技支撑计划项目:中兽药现代化技术研究与开发，项目编号：2008BADB4B00。

S853.91

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1007-1733(2012)07-0008-03