衍生化法测定水果中还原型谷胱甘肽（GSH）和总巯基含量

朴玉莲，沈 丽，韩 玲，崔胜云

（延边大学，长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林延吉 133002)

衍生化法测定水果中还原型谷胱甘肽（GSH）和总巯基含量

朴玉莲，沈 丽，韩 玲，崔胜云*

（延边大学，长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室，吉林延吉 133002)

用衍生化试剂5，5－二硫硝基苯甲酸（DTNB）对巯基化合物的衍生化反应和邻苯二甲醛（OPA）与GSH的荧光衍生化反应，分别采用UV－vis分光光度法和荧光光度法测定了猕猴桃、大枣、酸浆中总巯基含量和GSH的含量。被测样品中GSH和总巯基相对含量分布有较大的差异，其中猕猴桃和大枣中含有相对较高的GSH浓度分布，分别达0.7092、0.8374mol/g，酸浆中含有较高的总巯基含量分布，达1.4173mol/g。本测定方法的回收率达95.38%～101.9%，满足测定准确度的要求，总巯基含量和GSH含量测定最低检测限分别为9.6×10－7、2.69×10－7mol/L。

谷胱甘肽，巯基化合物，衍生化，5，5－二硫双－2－硝基苯甲酸，邻苯二甲醛

近年来，利用特有水果中的活性成分治疗糖尿病、肥胖症、代谢综合症等疾病受到人们的关注，这是因为某些水果中含特有的生物活性物质[1]。迄今，水果中活性成分研究主要涉及各类维生素、矿质元素、蛋白质、氨基酸和多酚类、活性糖类等[2－6]，但鲜见植物体内广泛分布的GSH和含巯基化合物含量的报道。众所周知，植物体内GSH、半胱氨酸、植物螯合素（PCs）、金属硫蛋白等含巯基化合物不仅在植物自身生理中扮演至关重要的角色，而且也对其他生命体提供类似的生物活性，如抗氧化、抗癌、延缓衰老等[7－12]。纵观植物样品活性成分的测定，其样品处理过程大多经过细胞破壁、提取、分离、衍生化等分析前处理。由于GSH等巯基化合物的巯基具有还原性且其肽键也能发生水解作用，故在样品前处理中相对苛刻的化学环境及氧化还原态的影响会导致其巯基氧化变性或肽键水解断裂，无法得到完整的GSH和巯基化合物的含量信息。这是目前许多植物样品还缺少GSH和巯基化合物含量信息的原因之一。本研究分别采用DTNB和OPA作为衍生化试剂，利用细胞破壁、衍生化为一体的样品前处理方法，用UV－vis分光光度法和荧光光谱法分别测定了猕猴桃、大枣、酸浆中总巯基含量和GSH的含量。本研究结果对GSH和巯基化合物含量信息及其活性地位、测定方法学研究提供了重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

还原型谷胱甘肽 Aldrich公司；半胱氨酸 Appli Chem公司；同型半胱氨酸 Sigma公司；5，5－二硫双－2－硝基苯甲酸（DTNB） 沃凯试剂公司；邻苯二甲醛

国药化学试剂公司；其他试剂 均为分析纯，实验用水 三次蒸馏水；水果样品 市售鲜品，其中野猕猴桃和酸浆为长白山区新鲜采摘品，大枣为山东产，猕猴桃为新西兰产。

RF－5301PC荧光分光光度仪 日本岛津公司；UV－8500紫外分光光度仪 天美公司；KQ－500DE数控超声波清洗器，UP－400S超声波细胞粉碎机，Mini－10K微型离心机，AP－220ZN空气泵，pHS－3C实验室酸度计。

1.2 实验方法

1.2.1 分析原理 利用衍生化试剂5，5－二硫双－2－硝基苯甲酸（DTNB）与巯基化合物、小分子巯基化合物和含巯基蛋白质发生衍生化作用，皆生成在可见光区内具有较强吸收的5－硫代－2－硝基苯甲酸（TNBA）盐黄色阴离子，故利用分光光度法可测定总巯基含量[13－15]。利用OPA衍生化试剂与GSH选择性衍生化作用生成三环荧光衍生化产物，用荧光分光光度法测定GSH含量[16]。利用含衍生化试剂的缓冲液作为提取液，采用细胞破壁、衍生化为一体的前处理方法，其衍生化反应原理见图1。

图1 巯基化合物与DTNB和OPA的衍生化反应Fig.1 Derivatizing reactions of slfhydryl compounds with DTNB and OPA

1.2.2 样品前处理 分别取市售新鲜猕猴桃、野猕猴桃、酸浆、大枣，洗净，去皮，沥干。分别取沥干后的样品1.0g移入50mL具塞锥瓶中，分别加入20mL含过量DTNB（2×10－4mol/L）和OPA（1×10－4mol/L）衍生化试剂的0.02mol/L PBS缓冲溶液，用超声细胞粉碎机破壁5min，超声波清洗仪振荡40min，抽滤，取上清液。取10mL上清液，加入2倍体积乙醇，放置30min，在8000r/min离心除蛋白5min，取上清液作为光谱测定供试品。测定时取1mL样品加入PBS缓冲液定容至10mL作为测试液。

1.3 数据处理

数据处理和画图及回归分析是使用Origin数理统计和画图软件。

2 结果与分析

2.1 巯基化合物衍生化反应光谱测定

DTNB与半胱氨酸和具有半胱氨酸残基的多肽及蛋白质的衍生化反应时无选择性，皆生成TNBA黄色离子[17]。为了探讨本实验条件下巯基化合物与DTNB衍生化反应的选择性，分别选择还原型谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（CySH）、同型半胱氨酸（HCySH）三种含巯基化合物，加入衍生化试剂OPA和DTNB，在PBS缓冲溶液中测定了荧光光谱和UV－vis吸收光谱，结果见图2。

图2 巯基化合物与OPA和DTNB混合溶液的荧光光谱图和UV－vis吸收光谱图Fig.2 Fluorescent and UV－vis spectra for the mixsture solutions of OPA and DTNB with sulfhydryl compounds

图2－A的结果表明，只有GSH和OPA作用生成荧光衍生化产物并在激发波长为350nm时，在427nm处发出灵敏的荧光发射，而CySH和HCySH不与OPA生成荧光衍生化产物。图2－B、C、D的结果表明，GSH和CySH与DTNB发生明显的衍生化反应并在λmax=417nm处出现强度几近相同的吸收峰（吸光度分别为0.1565和0.1583），说明等量的GSH和CySH生成相同量的衍生化产物TNBA，而HCySH不出现衍生化作用生成的新的吸收峰。由于HCySH比起CySH在旁链巯基（－SH）前包含一个额外的亚甲基，这使巯基更接近羧基并发生分子内缩合形成高半胱氨酸硫内酯导致无法发生衍生化作用。图2的结果说明，DTNB对半胱氨酸及GSH中半胱氨酸残基中巯基衍生化反应无选择性，而OPA只与GSH发生选择性衍生化作用。因此，利用DTNB衍生化试剂可测定包括GSH、CySH和含半胱氨酸残基的蛋白质的总巯基含量，利用OPA衍生化试剂可选择性测定GSH含量。

2.2 OPA衍生化法测定样品中GSH含量

利用OPA衍生化试剂，在测定荧光发射强度筛选10余种水果和药用植物的基础上，选择猕猴桃、野猕猴桃、大枣、酸浆作为样品，利用荧光光度法测定了它们GSH的含量。图3为标准加入法测定得到的荧光发射光谱图。

图3 OPA样品提取液及提取液中加入GSH标准溶液后的荧光光谱图Fig.3 Fluorescent spectra for the OPA sample extracts before and after additon of GSH sdandard solutions

图3结果表明，猕猴桃、野猕猴桃、大枣、酸浆的OPA提取液在λmax=427nm处出现明显的荧光发射。当在该提取液中加入标准系列的GSH溶液时，荧光发射强度与加入的GSH的浓度呈良好的线性关系，其线性回归方程及相关系数（r）依次为：I=14.735+ 13.152C（r=0.9992），I=13.183+14.602C（r=0.9997），I= 18.646+12.628C（r=0.9995），I=10.365+17.185C（r= 0.9997）。根据文献[18]的方法分别测定了检测限。猕猴桃、野猕猴桃、大枣、酸浆的GSH测定检测限分别为2.69×10－7、3.37×10－7、3.44×10－7、2.97×10－7mol/L。用标准加入法测定样品中GSH的含量，结果见表1。

表1 样品中GSH的含量测定结果Table 1 Determination results of GSH in the sample

2.3 DTNB衍生化法测定总巯基含量

利用DTNB作为衍生化试剂，采用标准加入法测定了猕猴桃、野猕猴桃、大枣、酸浆中总巯基含量。DTNB的提取液和该提取液中加入标准系列的GSH溶液后的UV－vis吸收光谱图见图4。

图4结果表明，猕猴桃、野猕猴桃、大枣、酸浆提取液在λmax=417nm处具有明显的吸收。当加入标准系列GSH溶液后其吸收强度与加入的GSH浓度呈良好的线性关系，对应的线性回归方程及相关系数分别为：A=0.0306+0.0224C（r=0.9984），A=0.0282+0.0236C（r=0.9988），A=0.0658+0.0328C（r=0.9991），A=0.0498+ 0.0215C（r=0.9982），检测限依次为9.7×10－7、1.98×10－6、7.20×10－5、4.71×10－6mol/L。利用标准加入法测定了样品中总巯基含量，结果见表2。

2.4 讨论与分析

从表1、表2的测定结果比较中发现，不同的样品其巯基化合物存在状态有很大的不同。根据测定结果绘制了不同样品的GSH、总巯基、总巯基与GSH含量差值分布图，结果见图5。

如图5所示，总巯基含量高低顺序依次为；酸浆＞大枣＞猕猴桃＞野猕猴桃。猕猴桃、大枣具有相对较高的GSH浓度分布，而酸浆中非GSH的巯基化合物含量分布较高。通过干扰实验发现10倍的维生素C、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸对GSH的测定无明显的干扰，但甘氨酸对OPA与GSH衍生化产物的测定具有明显的干扰使其测定结果偏低。

图4 DTNB样品提取液及该提取液中加入GSH标准溶液后的UV－vis吸收光谱图Fig.4 DTNB sample extracts before and after the addition of GSH sdandard solutions

图5 样品中各种巯基化合物含量分布图Fig.5 Distribution graph of different thiol compounds

从实验结果中还发现，样品前处理过程中衍生化反应顺序对总巯基含量测定具有重要的影响。因为，利用含DTNB衍生化试剂的PBS缓冲液对样品进行超声破壁、除蛋白后得到的样品测定结果与先用缓冲液超声破壁、除蛋白、再经衍生化得到的样品测定结果进行比较，发现前者分析信号（吸光度）明显大于后者。这一结果说明，细胞内存在含半胱氨酸残基的蛋白质成分且该蛋白质中的巯基也可与DTNB作用生成有色的TNBA衍生化产物离子。因此，本实验采用含衍生化试剂的缓冲液进行破壁、提取，再经去蛋白的样品前处理方法，可准确测定样品中包括含巯基蛋白在内的总巯基含量。

3 结论

3.1 猕猴桃、大枣、酸浆中含丰富的GSH等含巯基化合物。其中酸浆和大枣不仅含丰富GSH外还含有丰富的其他巯基化合物，猕猴桃中含丰富的GSH含量。上述样品所具有的抗氧化等生物学功能与其含有丰富的巯基化合物有关。

3.2 DTNB对GSH、CySH和含半胱氨酸残基的蛋白质无选择性。由于该分析方法是基于测定衍生化产物TNBA的吸收强度作为分析信号，因此通过含衍生化试剂的提取液与细胞破壁和衍生化为一体的样品处理模式，可不受除蛋白的影响而测定包括含巯基蛋白在内的总巯基含量。

[1]SAMIR D，SHALINI J，HARIOM Y.Exotic fruits as therapic complements for diabetes，obesity and metabolic syndrome[J].Food Research International，2011，44：1856－1865.

[2]高海生，肖月娟，刘秀凤，等.毛樱桃果实营养成分分析[J].食品科学，2002，23（6）：110－112.

[3]张奇志，邓欢英，林丹琼.广东杨梅果的主要营养成分分析[J].食品研究与开发，2012，33（3）：181－183.

[4]刘冬英，谢剑锋，方少瑛，等.榴莲的营养成分分析[J].广东微量元素学，2004，11（10）：57－59.

[5]张美莉，邓秋才，杨海霞，等.内蒙古欧李果肉和果仁中营养成分分析[J].氨基酸和生物资源，2007，29（4）：18－20.

[6]徐静.水果抗氧化活性与成分分析以及对衰老机体抗氧化功能的干预作用[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2006.

[7]麦维军，张明永.高等植物体内的谷胱甘肽[J].生物学通报，2005，40（6）：4－5.

[8]翟军鹇，夏蓓蓓，田婷婷，等.植物金属硫蛋白的研究进展[J].南方农业，2010（1）：87－89.

[9]VERENA L，ANDREAS W，AN Z G，et al.Exploiting plants for glutathione（GSH）production：Uncoupling GSH synthesis from cellular controls results in unprecedented GSH accumulation[J].Plant Biotechnology Journal，2010（8）：1－14.

[10]SANTIAGO I T，ANNA F，OLGA J，et al.Detection and Quantification of Unbound Phytochelatin in Plant Extracts of Brassica napus Grown with Different Levels of Mercury[J].Plant Physiology，2006（10）：742－749.

[11]PETERSON A G，OLIVER D J.Leaf－targeted phytochelatin synthase in Arabidopsisthaliana[J].PlantPhysiology and Biochemistry，2006，44：885－892.

[12]MINE E I，EMINE S，GUNGOR K.Age ralated changes in the glutathione redox system[J].Cell Biochemistry and Function，2002，20：61－66.

[13]陈震阳，潘立群，谭淑珍，等.血清中总巯基与非蛋白巯基含量分别测定研究[J].卫生毒理学杂志，1990，4（4）：268－269.

[14]夏一明.总谷胱甘肽的测定方法 [J].营养学报，1990，12（1）：18－22.

[15]李丽娜，李军生，阎柳娟.分光光度法测定食品蛋白质中二硫键的含量[J].食品科学，2008，29（8）：562－564.

[16]范崇东，王淼，卫功元，等.谷胱甘肽测定方法研究进展[J].生物技术，2004，14（1）：1－5.

[17]张光兴.DTNB与蛋白质巯基的相互作用[J].河北大学学报，1983，2：68－72.

[18]黄彦生，智艳芳，孔沈燕，等.用荧光分光光度法测量冠心病患者血浆谷胱甘肽[J].光谱学与光谱分析，2006，26（5）：936－940.

Reduced glutathione（GSH）and total thiol detection in some fruits by derivatizing methods

PIAO Yu-lian，SHEN Li，HAN Ling，CUI Sheng-yun*
（Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain＆Functinal Molecules，Ministry of Education Yanbian University，Yanji 133002，China）

Total thiol and reduced glutathione in Kiwi，Jujube and Fruit Physalis had been determined by UV-vis spectrometry and fluorescent spectrometry using 5，5-dithio-bis-nitrobenzoic acid（DTNB）and O-phthaldehde（OPA）as derivatizing agents.Relative amount between total thiol and GSH varies significantly，among which kiwi and jujube contained relative large amount of GSH with the content of 0.7092，0.8374mol/g respectively，while fruit physalis contained higher amount of total thiol with the centent of 1.4173mol/g.The determination of total thiol and GSH proceeded with the accurate and sensitive method with the recovery range of 95.38%～101.9%，and lowest detection limits reached to 9.6×10-7，2.69×10-7mol/L respectively.

glutathione；thiol compound；derivitize；5，5-dithio-bis-nitrobenzoic acid；O-phthaldehde

TS207.3

A

1002－0306（2012）20－0060－05

2012－08－01 *通讯联系人

朴玉莲（1987－），女，硕士研究生，研究方向：有机分析。

国家自然基金资助项目（21165021）。