犬急性心肌梗死早期冠状动脉旁路移植术对梗死周边区心肌神经纤维密度的影响

张文峰 谷天祥 郑志强 战润庆 马在启 林科先

急性心肌梗死后存在着交感神经重构现象，表现为交感神经再生和增生，以梗死周边区最为明显。交感神经重构可能与心肌梗死慢性期室性心律失常和猝死的发生有关［1-3］。如能在心肌梗死早期采取积极的干预措施，使心脏神经的再生和增生达到适当的水平，而不是异常重构，可能对心肌梗死后室性心律失常甚至猝死的预防起到更积极的作用。本研究通过在犬急性心肌梗死早期行冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting，CABG)作为干预手段，探讨犬急性心肌梗死早期CABG对梗死周边区心肌的神经纤维密度的影响及意义。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

健康杂种犬30只(由中国医科大学动物实验中心提供)，2～4岁，雌雄不拘，体质量 16～26 kg。按制模手术时间随机分为心肌梗死行CABG实验组(22只)和未行CABG的心肌梗死对照组(8只)。实验组中，分别在心肌梗死后第1、2、4和6周行CABG，其中第2周4只，其余各组6只;分别为4个实验组设立未行CABG的心肌梗死对照组，每组2只。一抗为大鼠抗小鼠GAP43抗体(1∶250)和酪氨酸羟化酶(TH)抗体(1∶250)购自Takara USA公司，二抗为通用型P物质(SP)抗体购自武汉博士德公司，2.5倍手术放大镜(Micro 250N)购自 General Scientific Corporation公司，显微手术器械、心电图机、心电监护仪、小型动物呼吸机购自上海医疗器械厂，6-0、7-0显微缝线购自上海医用缝合针厂，Metamorph UIC(US)软件及 Olympus/Evolution MP 5.0/BX51(JP)显微镜组成的计算机图像处理系统由中国医科大学中心实验室提供。

1.2 急性心肌梗死模型建立

所有犬以戊巴比妥钠30 mg/kg肌肉麻醉后经口气管插管，接呼吸机，连接心电监护仪同时四肢刺入针形电极行心电图检测，取左前胸第四肋间作前外侧切口进胸，切开心包暴露心脏，游离并结扎冠状动脉前降支第7段(左主干发出第一对角支后)制备心肌梗死模型。以心电图Ⅰ、Ⅱ、aVL导联ST段抬高0.2 mV、T波倒置或双向、病理性Q波出现或心肌颜色明显变暗作为心肌梗死模型手术成功标志。彻底止血，关闭胸腔，待犬自主呼吸恢复拔除气管插管。

1.3 标本制备

图1 犬心肌GAP-43和TH表达(免疫组化染色，×400)

模仿患者非体外CABG过程对实验组犬进行操作，取经过深低温处理的犬异体股动脉作为桥血管［4］，远端吻合(7-0)于心脏靶血管，近端吻合(6-0)于胸部降主动脉。暴露心脏靶血管前给予肝素1 mg/kg，血管吻合后给予鱼精蛋白0.5～1.0 mg/kg进行中和。术后肌注80万单位青霉素，2次/d，连续3～5 d，普食喂养。所有实验犬在行CABG术后8周(心肌梗死对照组在相应的时间段)开胸，切取梗死周边区心肌(以结扎线为标志，梗死苍白区边缘至外周3～5 mm)及正常心肌组织(取未结扎冠状动脉相应区域的心肌组织作为空白对照组)，将所取组织立即投入4%多聚甲醛溶液中，固定18～24 h后进行石蜡包埋，垂直于心外膜切片。

1.4 免疫组化染色及神经纤维密度检测

采用免疫组化方法检测标本的生长相关蛋白43(GAP-43)、TH表达。参照试剂盒提供的步骤进行染色。神经纤维密度由Metamorph UIC(US)软件及Olympus/Evolution MP 5.0/BX51(JP)显微镜组成的计算机图像处理系统进行定量测定。每只测6张切片(两种一抗各3张)，神经纤维密度取3张切片的平均值。

表1 犬急性心肌梗死早期行CABG梗死周边区神经纤维密度()

表1 犬急性心肌梗死早期行CABG梗死周边区神经纤维密度()

注:与空白对照组和其他时间行CABG实验组比较，aP＜0.05;与空白对照组和各实验组比较，bP＜0.01;与空白对照组、第1、2和4周行CABG组比较，cP＜0.05

组别 犬(只) GAP-43(μm2/mm2) TH(μm2/mm2) TH/GAP-43(%)空白对照组8625.4±121.7 435.7±106.9 69±6实验组第1周行CABG 4 656.9±147.5 440.2±105.2 67±4第2周行CABG 4 683.0±157.2 484.0±112.2 71±4第4周行CABG 4 737.0±158.3 521.8±100.1 71±7第6周行CABG 4 847.8±169.4 692.4±117.1a 82±2a心肌梗死对照组 8 1333.3±169.1a 1082.0±114.3b 81±2a

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 心肌梗死模型制备及CABG情况

心肌梗死模型制备过程中所有犬均存活。每个实验组均有4只存活至终点，均顺利完成各项指标的测量(其中第1、4、6周行CABG实验组均有2只死亡，分别死于术后心力衰竭、呼吸衰竭和术中失血)。解剖心脏可见梗死区颜色苍白，与非梗死区分界明显。

2.2 各组间GAP-43和TH表达水平的比较

心肌梗死对照组的GAP-43和TH表达水平均明显高于空白对照组及各实验组(均为P＜0.01);第6周行CABG组TH表达水平明显高于空白对照组及其他时间行CABG实验组(均为P＜0.05);心肌梗死对照组及第6周行CABG实验组的交感神经纤维密度TH/GAP-43明显高于空白对照组及其他时间行CABG实验组(均为P＜0.05)，见表1。

3 讨论

急性心肌梗死时支配心脏的神经受到损伤，在心肌局部或循环中增加的神经生长因子(NGF)等神经营养因子的作用下，受损的神经发生重构，以梗死周边区最为明显［5］。包绕纤维瘢痕的梗死周边区在心肌梗死后慢性期室性心动过速、心室颤动的发生机制中起重要作用［6-7］。大多数室性心律失常发生在心肌梗死早期，心肌缺血或梗死引起心肌失神经支配，当心肌受去甲肾上腺素及异丙肾上腺素作用时出现不应期过度缩短，剂量-效应曲线向左上移位即失神经超敏反应［8］。心肌梗死早期交感神经适度的再生是机体合理的损伤修复反应，但是慢性期的再生往往是不均一的过度增生［9-10］，心肌梗死后再生神经纤维比附近未损心肌神经纤维直径粗、数量多，且可单独存在，或聚集成网状结构，空间分布紊乱，后期在瘢痕周围可见大量的神经纤维复合体，此时神经功能可能异常，不规律地释放神经递质，导致局部组织不应期及冲动传导速度的差异，形成折返环的机会增加，从而导致心律失常的发生［9］。

新生神经纤维以交感神经纤维为主［10］。交感神经活性增强是由于释放大量的儿茶酚胺作用于机体β1肾上腺素受体，通过环腺苷磷酸(cAMP)途径引起钙离子大量外流、后除极形成，导致室性心律失常的发生［11］。交感神经过度增生带来交感活性的亢进［12］，梗死周边区心肌细胞长期处于高浓度去甲肾上腺素(NE)的作用下，辅以缺血缺氧等不利因素共同导致局部心肌电生理性质发生改变。

在急性心肌梗死时左侧交感神经结的mRNA水平并不升高，可以推测mRNA不可能来源于心外交感神经节，更有可能来源于梗死损伤部位附近的非神经细胞，其中也包括有髓神经纤维［13］，神经损伤修复时雪旺氏细胞也表达 GAP-43［14］，这些细胞作为基质细胞常在梗死心肌出现［15］，可能是这些神经相关因子mRNA的来源所在。第二个可能是来源于心脏内源性肾上腺素细胞［16］，这些TH表达阳性细胞大部分分布在外周血管，直径大约是心肌细胞的一半。心肌梗死也可能触发这些细胞表达其他神经相关因子的mRNA。

本研究显示，心肌梗死未行CABG组的GAP-43和TH表达水平明显高于空白对照组及实验组;第6周行CABG组的TH表达水平明显高于空白对照组及其他时间行CABG实验组;心肌梗死对照组及第6周行CABG实验组的TH/GAP-43(%)明显高于空白对照组及其他时间行CABG组。提示犬急性心肌梗死早期CABG可以减低梗死周边区心肌中神经纤维密度，尤其是4周内行CABG可以减轻梗死周边区心肌交感神经重构。

总之，犬急性心肌梗死早期CABG可以大大减低梗死周边区心肌中神经纤维密度，即早期CABG可以减轻梗死周边区心肌交感神经重构。研究神经重构的临床意义重大，如能在心肌梗死早期就采取积极的手段预防交感神经的过度再生，使其达到合理的再生状态，就可能对防止室性心律失常和猝死的发生产生积极的作用。另外，急性心肌梗死早期CABG也可以减轻心肌局部肾素活性和血管紧张素对心肌的不利影响［17］，临床上我们已经开展了急性心肌梗死患者CABG，并取得了良好疗效［18］。

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