盆炎消凝胶中赤芍、连翘等药材的提取工艺

2012-10-25王海凌辛义周

药学研究 2012年10期

王海凌，辛义周

(山东中医药大学附属医院，山东济南250011)

盆炎消凝胶［1］为治疗慢性盆腔炎的一种纯中药制剂，由赤芍、连翘、丹参等药物组成，具有活血化瘀，清热凉血，行气散结，消肿止痛之功，适用于慢性盆腔炎瘀热蕴结夹湿之证。原方为水煎灌肠使用，我们在原方药基础上，采用现代制药技术，将剂型改为凝胶剂。

赤芍含芍药苷、β－谷甾醇、鞣质、牡丹酚、芍药花苷、苯甲酸、树脂、挥发油、三萜类等。其活性成分芍药苷具有镇静、抗炎、镇痛、解热及抗惊厥、降压和抗菌作用［2］。连翘的主要成分是连翘酯苷A、C、D、连翘苷、咖啡酸、芦丁、连翘脂素、连翘酚、三萜以及β－谷甾醇等化合物，其主要生物活性成分连翘苷具有较强的抑菌作用［3］;连翘酚、连翘水浸膏也有抗菌作用［4，5］。赤芍、连翘等均含有水溶性有效成分，可合并采用水提取方法。

1 材料与试药

1.1 仪器 AE200S电子分析天平(梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司);岛津LC－10A高效液相色谱仪(日本岛津公司);R－205型旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司);QZ－5型高速离心喷雾干燥机(江苏省锡山市喷雾干燥机厂)。

1.2 试药甲醇－乙腈(天津四友生物医学技术有限公司，色谱纯)。药材购自济南药材站，经鉴定，赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。连翘为木犀科植物连翘 Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果实。

2 实验方法与结果

2.1 正交实验设计赤芍、连翘等所含的活性成分皆为水溶性成分，传统提取方法为水煎煮，本研究选用水回流提取的方法。以芍药苷、连翘苷的提取率为指标，对影响提取的主要因素加水量、回流时间、提取次数等三个因素进行L9(34)正交实验设计，优选最佳提取工艺。实验因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.2 提取工艺将赤芍、连翘等饮片，按正交设计要求，加一定量水，浸泡30 min，控制温度回流一定时间，每个样品提取一定次数，合并提取液，旋转蒸发浓缩至1∶3(药材－药液)，测定并计算芍药苷和连翘苷的提取率。

2.3 工艺指标的测定方法

2.3.1 芍药苷的含量测定方法色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相;甲醇－0.05 mol·L－1磷酸二氢钠溶液(30∶70)为流动相;检测波长为230 nm，理论塔板数按芍药苷峰计算，应不低于3 000。

对照品溶液的制备:精密称取芍药苷对照品13.2 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密吸取2 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL中含芍药苷 52.8 μg)。

供试品溶液的制备:精密量取提取液1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声提取10 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

线性关系考察:精密称取芍药苷对照品13.2 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液，精密吸取1，3，5，7，9 mL 置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液，分别进样20 μL测定，测得积分面积A分别为 471 719、1 233 700、2 021 839、2 632 702、3 354 560，以积分面积Y为纵坐标，芍药苷浓度X(μg·mL－1)为横坐标，绘制标准曲线。结果进样量在 26.4 ～237.6 μg·mL－1范围内线性关系良好，回归方程为Y=13 569X+151 732，相关系数r=0.999 1。

重现性试验:按上述方法测定样品液6次，RSD=0.97%，表明重现性良好。

回收率试验:精密量取已知含量的样品约1 mL，精密加入含芍药苷对照品为52.8 μg·mL－1的甲醇溶液 24 mL，按样品测定方法进行测定。测得平均回收率99.12%，RSD为1.95%。

精密度试验:按上述色谱条件取芍药苷浓度为52.8 μg·mL－1的对照品溶液进样6次，测定积分面积 A，RSD=0.91%。显示精密度良好。

稳定性试验:对供试品溶液在 0、1、2、4、8、12、24 h 进样测定7次，RSD=0.85%。表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，代入公式计算，即得。

2.3.2 连翘苷的含量测定方法色谱条件与系统适用性试验:用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相;乙腈－水(25∶75)为流动相;检测波长为277 nm，理论塔板数按连翘苷峰计算，应不低于3 000。

对照品溶液的制备:精密称取连翘苷对照品10.4 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每1 mL中含连翘苷 104 μg)。

供试品溶液的制备:精密量取提取液20 mL，用三氯甲烷分3次水浴回流萃取，每次30 mL三氯甲烷萃取30 min，合并3次三氯甲烷液，水浴蒸干，加中性氧化铝1.0 g拌匀，加于中性氧化铝柱(100～120目，内径2 cm)上，用70%乙醇120 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解后转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

线性关系考察:精密称取连翘苷对照品10.4 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液，精密吸取1、3、5、7、9 mL 置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液，分别进样20 μL，测定，测得积分面积Y分别为 115 657、386 912、631 320、871 746、1 166 285，以峰面积为纵坐标，连翘苷浓度X(μg·mL－1)为横坐标，绘制标准曲线。结果进样量在20.8 ～187.2 μg·mL－1范围内线性关系良好，回归方程为Y=6 212.6X－12 139，相关系数 r=0.999 4。

重现性试验:按上述方法测定样品液6次，RSD=0.94%，表明重现性良好。

回收率试验:精密量取已知含量的样品约20 mL，精密加入含连翘苷对照品为104 μg·mL－1的甲醇溶液50 mL，按样品测定方法进行测定。测得平均回收率 99.49%，RSD为2.04%。

精密度试验:按上述色谱条件取连翘苷浓度为104 μg·mL－1的对照品溶液进样 6次，测定积分面积 A，RSD=0.91%。显示精密度良好。

稳定性试验:对供试品溶液在 0、1、2、4、8、12、24 h 进样测定7次，RSD=0.97%。表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，代入公式计算，即得。

2.4 指标测评及处理本研究中赤芍和连翘在处方中的作用同等重要，因此按公式y=y1(芍药苷提取率)+y2(连翘苷提取率)计算综合得分作为工艺筛选指标。正交设计结果见表2。

2.5 方差分析见表3。

由方差分析表可以看出，本实验设计中，因素B、C对提取芍药苷和连翘苷的影响显著，因素A的影响不显著，结合直观分析和方差分析及生产实际，确定最佳搭配为A1B3C2，即水提取工艺的最佳方案为:加8倍量水，回流提取两次，每次 1.5 h。

2.6 工艺重现性按照上述最佳工艺条件制备三批样品，分别测定各指标，证明该工艺重现性良好，结果见表4。