葵花籽壳黑色素提取鉴定及抗氧化性研究

赵 萍，王 雅，魏明广，郭 涛，张 轶，亓文静，柴原琴，林樱姬

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050；

2.甘肃敬业农业科技有限公司，甘肃武威 733300）

葵花籽壳黑色素提取鉴定及抗氧化性研究

赵 萍1，王 雅1，魏明广2，郭 涛1，张 轶1，亓文静1，柴原琴1，林樱姬1

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050；

2.甘肃敬业农业科技有限公司，甘肃武威 733300）

利用碱提酸沉和超声波等方法从葵花籽壳中提取黑色素，Folin-Ciocalteu法测定葵花籽壳黑色素粗提取物中总酚的含量，采用单因素和正交实验确定葵花籽壳黑色素提取的最佳工艺条件，紫外和红外光谱法初步鉴定黑色素；以VC、没食子酸为对照，测定黑色素粗提物与纯化黑色素的还原力和清除DPPH·的能力。结果表明，碱提酸沉葵花籽壳黑色素粗提物呈黑色、无光泽，最优提取条件下氢氧化钠浓度为0.5mol/L，提取时间1.5h，料液比1∶25，提取温度25℃下，黑色素粗提物的得率为12.37%（RSD 2.14%）；纯化的黑色素呈黑色、有金属光泽，得率为2.07%（RSD 9.27%）；粗提物总酚含量以没食子酸计为0.48%。葵花籽壳黑色素亚硫酸钠溶液在292nm波长有最大吸收峰，且吸光度与黑色素的浓度呈正相关，红外光谱图有黑色素红外吸收特征。黑色素的还原力和清除DPPH·自由基的能力明显比VC低，在同一浓度下，纯化前后黑色素的抗氧化性能力无明显改变。

葵花籽壳黑色素，提取，总酚，还原力，DPPH·

葵花，又名向日葵，为菊科植物，我国各地均有栽培，资源十分丰富。葵花籽壳是许多粮油厂、食品厂的废弃物。葵花籽壳色素含量较高，提取工艺简单，提取剂可以反复使用。在已开发的天然色素中，红色[1]、黄色、绿色等品种较多，蓝色则较少，黑色则极为稀缺。葵花籽壳黑色素作为一种天然黑色素，目前的研究较少[2-3]。本文对葵花籽壳黑色素的提取工艺以及其抗氧化能力进行了系统的研究，对葵花籽壳黑色素的利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葵花籽壳 甘肃敬业农业科技有限公司提供；没食子酸（gallic acid）、DPPH·（二苯代苦味酰基自由基） SIGMA-ALDRICH.Inc；维生素C 天津市医药工业技术研究所；乙酸 天津市福晨化学试剂厂；钨酸钠 天津市化学试剂四厂；磷酸 天津市化学试剂一厂；盐酸 荥阳市黄河化工试剂厂；硫酸锂 天津市密欧化学试剂开发中心；铁氰化钾 国药集团化学试剂有限公司；亚硫酸钠、无水碳酸钠 西安化学试剂厂；氢氧化钠 天津市恒兴化学试剂制造有限公司；大孔树脂（AB-8） 南开大学化工厂；以上试剂均为分析纯；钼酸钠 广东泰山化工厂，化学纯；FCR试剂 自制。

Cary 50紫外可见分光光度计 美国瓦里安公司；FT-IR8400s红外光谱仪 日本岛津公司；RE52-86A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DEF-6020真空干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；FD-1-SSA冷冻干燥机 北京博医康实验仪器公司；JY99-2D超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；ZF-7三用紫外分析仪 金坛市盛蓝仪器制造有限公司；TG16-WS台式高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葵花籽壳黑色素的提取 参照文献[4-5]，采用碱提酸沉提取。葵花籽皮的黑色素属于邻苯二酚型黑色素，易溶于碱溶液，不溶于水和常见的有机溶剂，因此采用碱溶液提取黑色素，再用酸溶液中和，使黑色素沉淀析出。

采用单因素和正交实验，用FCR试剂总酚测定方法（1.2.4），在765nm波长处测定溶液的吸光值，以确定黑色素提取的最佳条件[6-7]。

根据预实验，确定提取溶剂的浓度、料液比、提取时间和提取温度，是葵花籽皮中黑色素提取效果的关键因素。

提取溶剂的浓度：以0.25～2.0mol/L NaOH水溶液为提取溶剂，料液比为1∶15，在25℃下提取1h。

提取时间：以0.5mol/L NaOH水溶液为提取溶剂，料液比为1∶15，在25℃提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h。

料液比：以0.5mol/L NaOH水溶液为提取溶剂，在25℃提取1.5h，料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。

提取温度：以0.5mol/L NaOH水溶液为提取溶剂，提取1.5h，料液比为1∶25，提取温度分别为25、35、45、55℃。

根据单因素实验结果，采用四因素三水平L9（34）正交实验设计（见表1），确定最佳工艺条件。

称取3g粉碎的原料，在超声功率为100W的条件下，用一定体积、一定浓度的氢氧化钠溶液溶解，在一定温度、一定时间条件下，超声提取，离心，取上清液，加入等体积的2mol/L盐酸，静置，离心，取沉淀用1mol/L氢氧化钠溶解，同等体积的2mol/L盐酸沉淀，反复此操作3次，最后得黑色素沉淀。所得沉淀用30mL浓度为0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解，定容到250mL，混合均匀，待测总酚含量。

表1葵花黑色素提取的L9（34）正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test of sunflower melanin extraction L9（34）

1.2.2 葵花籽壳黑色素的提取纯化 取一定量经干燥、粉碎的葵花籽壳，采用通过正交实验所得的最佳提取工艺条件，进行超声波碱提酸沉提取，沉淀物进行冷冻干燥，即得葵花籽壳黑色素粗提物。

粗提物经过AB-8大孔树脂进行纯化，用60%乙醇洗脱，收集峰值处洗脱物，浓缩后冷冻干燥得纯化的葵花籽壳黑色素。

1.2.3 葵花籽壳黑色素的鉴定 取少量上述黑色素溶解于0.003mol/L亚硫酸钠水溶液中，并用同样的亚硫酸钠水溶液做对照[5]，在Cary 50紫外可见分光光度计下，于200～800nm范围内进行全波长扫描。少量干燥后的上述葵花籽壳黑色素固体用溴化钾压片后做红外光谱扫描。

1.2.4 葵花籽壳黑色素中总酚含量的测定 精确称取没食子酸标准品25mg，用水溶解并定容到250mL，得0.1mg/mL的对照品标准溶液。分别准确量取标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL容量瓶中，各加6mL水，摇匀，再加0.5mL FCR试剂，摇匀。1min之后，加入20%碳酸钠溶液1.5mL，混匀定容。在室温下反应2h，于765nm波长下比色，测定吸光度，建立标准曲线[6]。黑色素总酚含量测定方法同标准曲线绘制方法。

1.2.5 葵花籽壳黑色素还原力的测定 取不同浓度的样液2.5mL，加入0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.6）和1%K3Fe（CN）6各2.5mL，混合均匀后于50℃水浴反应20min，急速冷却，取出后加入2.5mL 10%乙酸混匀，而后于3500r/min离心10min。取上清液5.0mL加入蒸馏水5.0mL，0.1%FeCl31.0mL，于700nm处测定吸光值，吸光值越大，则还原力越强[7]。

1.2.6 葵花籽壳黑色素对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）清除能力的测定 分别取2.5mL浓度为0.18×10-3、0.42×10-3、0.60×10-3、1.20×10-3、1.8×10-3、3.0×10-3mg/mL葵花籽壳黑色素粗提物溶液与纯化黑色素溶液，再分别加入2.5mL浓度为0.025mg/mL的DPPH·乙醇溶液并立即混匀，在室温下遮光反应30min，用Cary 50紫外可见分光光度计于516nm处在一定时间间隔内测定吸光度，以维生素C、没食子酸作为对照[8-9]。以试样中浓度对DPPH·的清除率进行作图，得到SR为50%的所需要样品的浓度，即得IC50。

式中，Ai——为样液与DPPH·乙醇溶液混合后在波长516nm处的吸光度值；Aj——为样液与蒸馏水混合后在波长516nm处的吸光值；A0——DPPH·乙醇溶液与蒸馏水混合后在波长516nm处的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 葵花籽壳黑色素的提取条件优化

2.1.1 葵花籽壳黑色素提取单因素实验 葵花籽壳黑色素提取单因素实验结果见图1～图4。

图1 氢氧化钠浓度对葵花黑色素提取的影响Fig.1 Effect of concentration of the sodium hydroxide on the extraction of sunflower melanin

图2 提取时间对葵花黑色素提取的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction of sunflower melanin

图3 料液比对葵花黑色素提取的影响Fig.3 Effect of the solid-liquid ratio on the extraction of sunflower melanin

图4 提取温度对葵花黑色素提取的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction of sunflower melanin

由图1以看出，溶液吸光度随着氢氧化钠浓度的增大而减小，当氢氧化钠浓度为0.5mol/L时，溶液吸光度最大，NaOH浓度过高会导致色素分解，降低得率。因此，选取氢氧化钠浓度为0.5mol/L。

由图2可以看出，溶液吸光度随着提取时间的增大而增大，但是到一定时间后，提取溶液中的多酚可能受温度的影响而减少，也可能时间过长导致色素降解，在时间1.5h，溶液的吸光度达到最大值，因此确定提取时间为1.5h。

由图3可以看出，溶液吸光度随着料液比的增大而增大，但是到一定范围后，吸光值下降，在料液比1∶25时达到最大值，因此确定料液比为1∶25。

由图4可以看出，溶液吸光度随着提取温度的增大，先增加后减小，提取温度为25℃时，吸光度最高。在实验温度范围内，25℃为较佳提取温度。

以总酚测定吸光度为指标，葵花籽壳黑色素提取单因素实验结果表明，当氢氧化钠浓度为0.5mol/L、提取时间为1.5h、料液比为1∶25、提取温度为25℃时，黑色素的提取效果最好。

2.1.2 最佳提取条件的正交实验 根据单因素实验的最佳结果分别设计正交实验，正交实验结果见表2。

表2葵花黑色素提取的L9（34）正交实验结果Table 2 The results of orthogonal test of sunflower melanin extraction L9（34）

由表2中极差R可以看出，RA＞RC＞RB＞RD，即影响因素的影响程度由高到低分别为：氢氧化钠浓度＞料液比＞提取时间＞提取温度；最优组合为A2B2C2D2，即葵花籽壳黑色素提取最佳工艺条件为：氢氧化钠浓度0.5mol/L，提取时间1.5h，料液比1∶25，提取温度25℃。方差分析结果表明，各因素及水平间无显著差异。

在最佳提取工艺条件下，提取葵花籽壳黑色素，2次重复黑色素粗品得率为12.37%，RSD 2.14%。

2.2 葵花籽壳黑色素的纯化

黑色素在碱性溶液中溶解，在酸性溶液中形成沉淀，且在酸性条件下的水解作用可以去除与黑色素结合的蛋白质、碳水化合物以及脂类物质[10]。利用易溶于碱不溶于酸的性质对葵花籽壳黑色素粗品进行多次溶解沉淀洗涤，以除去葵花籽壳黑色素粗提物中的杂质，所得产物为葵花籽壳黑色素粗提物，呈黑色，无光泽。粗提物再经过大孔树脂处理纯化，冻干后得纯化的黑色素，呈黑色，带金属光泽，得率为2.07%（以葵花籽壳计），2次重复，RSD 9.27%。

2.3 葵花籽壳黑色素的鉴定

采用Cary50紫外可见分光光度计全波长扫描，未经处理的葵花籽壳黑色素溶液干扰峰较多（图5a），不便于测定，而和色素亚硫酸溶液在292nm处有最大吸收峰，并随波长增加，其吸光值下降（图5b）。葵花籽壳黑色素红外光谱图（图6）具有经典的黑色素红外吸收特征，即在3416.43、1647.42cm-1处各有一个吸收峰，在3416.43cm-1附近有一强而宽的单吸收峰，是由O—H的伸缩振动（3450cm-1）产生的，1647.42、1565.79cm-1吸收峰是由芳环骨架振动产生的，1162.25、1117.41cm-1处是C-O键的特征峰，另外在1440.55cm-1附近有烷烃的C-H变形振动吸收。这与王岩等[11]报道的葵花籽壳黑色素可能是邻苯二酚型的结果一致。

图5 葵花籽壳黑色素全波长扫描图谱Fig.5 Full wavelength scanning spectra of sunflower seed shells melanin

图6 葵花籽壳黑色素红外光谱图Fig.6 IR spectrum of sunflower seed shells melanin

2.4 葵花籽壳黑色素中总酚含量

以没食子酸作为标准品，测定葵花籽壳黑色素总酚含量。没食子酸在浓度1～9μg/mL内与其吸光值呈线性关系，其线性回归方程为Y=0.093x-0.0062，R2=0.9995，得黑色素粗品中的总酚含量为4.67mg/mL，即葵花籽壳中总酚含量以没食子酸计为0.48%。

2.5 葵花籽壳黑色素的还原力

还原力是潜在抗氧化性能的重要体现。还原力实验结果如图7所示，在同一浓度下，各样品间存在显著性差异，葵花籽壳黑色素的还原力明显低于VC，即在相同浓度下黑色素的还原力低于抗坏血酸，纯化后的黑色素还原力略大于黑色素粗品，但没有显著提高，即黑色素纯化前后的还原力虽有变化，但没有明显的改善。

图7 葵花籽壳黑色素与VC还原力Fig.7 Reducing power of melanin of sunflower seed shells and VC

2.6 葵花籽壳黑色素对DPPH·清除能力的测定

清除自由基的机制在于抗氧化剂抑制脂质过氧化。DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则表明受试物具有降低羟基自由基、烷基自由基或过氧化自由基和打断脂质过氧化链式反应的作用。通过IC50值比较各物质清除DPPH·自由基的能力，若所需要的IC50浓度越小，表明其清除率越大，抗氧化能力越强。由图8可以看出，VC、纯化黑色素、黑色素粗品、没食子酸清除DPPH·自由基50%所需要的浓度依次为0.682、0.956、2.26、4.15mg/L，因此它们对DPPH·自由基清除能力大小为：VC＞纯化后黑色素＞黑色素粗品＞没食子酸，纯化后黑色素清除自由基的能力略有提高。

图8 葵花籽壳黑色素及不同抗氧化剂清除DPPH·自由基的IC50Fig.8 IC50value of DPPH radical scavenging activity of the melanin from sunflower seed shell

3 结论

3.1 利用黑色素易溶于碱不溶于酸的性质，在最优提取条件：氢氧化钠浓度0.5mol/L，提取时间1.5h，料液比1∶25，提取温度25℃下，葵花黑色素粗品的得率为12.37%，RSD 2.14%，纯化黑色素得率为2.07%，RSD 9.27%，说明以葵花籽壳为原料提取黑色素有较高的得率。

3.2 葵花籽壳黑色素具有清除DPPH·自由基的能力，纯化后黑色素的抗氧化能力强于没食子酸和黑色素粗品，它们的抗氧化性能的强弱顺序为VC＞纯化后黑色素＞黑色素粗品＞没食子酸。

3.3 葵花籽壳黑色素亚硫酸钠溶液的最大吸收波长为292nm，红外光谱扫描确定其属于邻苯二酚型结构。但由于紫外和红外光谱法在研究生物大分子结构中的局限性，有关葵花籽壳黑色素分子结构尚需要结合其他分析手段来进一步确证。葵花籽壳黑色素可作为食品和化妆品的天然着色剂，具有很高的开发价值和应用前景，有望成为一种新型的天然植物黑色素。

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Study on extraction，identification and antioxidant activity of melanin of sunflower seed shell

ZHAO Ping1，WANG Ya1，WEI Ming-guang2，GUO Tao1，ZHANG Yi1，QI Wen-jing1，
CHAI Yuan-qin1，LIN Ying-ji1
（1.School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China；2.Gansu Jingye Agricultural Science&Technology Co.，Ltd.，Wuwei 733300，China）

The melanin of sunflower seed shell（MS） was extracted based on its characteristics of dissolving in alkaline solution and precipitating in acid solution assisted with ultrasonic.Folin-Ciocalteu（FC） method was used to determine total phenol content，single factor and orthogonal tests were used to determine the optimum extract conditions of MS，UV and infrared spectroscopies were used to identify the structure，the reducing power and ability of scavenging DPPH·were used to evaluate the antioxidant activity against the same concentration of VCand gallic acid.The results showed that optimum extract conditions were 0.5mol/L NaOH，time for 1.5h.，solid-liquid ratio of 1∶25 at 25℃，the crude extract of MS extracted by alkaline and acid was black and lacklustre with a yield of 12.37%，RSD 2.14%，and the purified MS was metallic luster with a yield of 2.07%，RSD 9.27%.The total polyphenol content of crude extract of MS was 0.48%calculated as GAE.The wavelength of maximum absorption peak was 292nm in the solution of sodium sulfite scanned by Cary 50 UVVis spectrophotometer，and absorbance and the concentration of melanin was positively correlated at 292nm.The patterns of classic characteristic absorption of melanin were shown in the ultraviolet and infrared spectrogram，respectively.With the same concentration，the antioxidant capacity of purified melanin was nearly same as that of the crude extract，lower than VCbut higer than gallic acid.

melanin of sunflower seed shell；extraction；total polyphenol；antioxidant activity；DPPH·

TS229

A

1002-0306（2012）22-0133-05

2011－12－13

赵萍（1964-），女，教授，研究方向：农产品产后贮藏、加工理论和新技术。

甘肃省自然科学研究基金计划（0803RJZA044）。