鲁米诺-铁氰化钾流动注射化学发光体系测定饮用水中ɑ-茄碱

朱定波，马 强，燕 廷，滕久委，唐书泽

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州 510632）

鲁米诺-铁氰化钾流动注射化学发光体系测定饮用水中ɑ-茄碱

朱定波，马 强，燕 廷，滕久委，唐书泽*

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州 510632）

建立一种快速测定ɑ-茄碱的新方法，利用鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系，结合流动注射技术，对ɑ-茄碱进行测定。实验结果表明，ɑ-茄碱对鲁米诺-铁氰化钾体系发光反应有明显的抑制作用，在最佳实验条件下，该方法的线性范围为8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL，检出限为6.09×10-5mg/mL，RSD为2.1%（n=11）。 该方法具有操作简单、自动化程度高、成本低廉、容易实现在线检测以及即时预警等优点，可用于饮用水中ɑ-茄碱的快速检测。

鲁米诺，铁氰化钾，化学发光，ɑ-茄碱

马铃薯植株和其块茎中普遍含有一种有异味、有毒的生物碱，通称为龙葵素、龙葵碱、茄碱、马铃薯素等[1]。这种生物碱不是单一成分，而是一类具有糖苷键的含氮甾体化合物，主要成分是ɑ-茄碱（ɑsolanine）和ɑ-卡茄碱（ɑ-chaconine），其含量达到龙葵素总量的95%以上[2]，且ɑ-茄碱在一定范围内变化[3]，据相关研究报道ɑ-茄碱是主要的制毒物质[4]，即ɑ-茄碱可以作为龙葵素毒性的一个指标。通常情况下，龙葵素含量较低时不会影响食用品质，但当马铃薯因储藏不当、发芽变绿或腐烂时，会导致龙葵素含量大幅度升高，若人畜食用0.2g龙葵素时即可出现中毒症状，严重者会出现致畸或死亡的危险[5]。龙葵素的致毒机理是抑制体内的胆碱酯酶的活性，胆碱酯酶催化神经递质乙酰胆碱的水解，生成胆碱和乙酸，该酶被抑制失活后，造成乙酰胆碱的积累，胆碱会使神经兴奋增强，引起胃肠肌肉痉挛等一系列中毒症状[6]。龙葵素中毒已有发生，2009年长春东亚经贸新闻就报道了一起九台市庆阳中心学校中小学生龙葵素中毒事件[7]。虽然饮用水中目前没有中毒报告，但龙葵素容易获得，其潜在的危害不容忽视。因此，研究建立快速监测饮用水中龙葵素的变化，对饮用水早期安全预警具有重要的意义。目前国内外对于马铃薯中ɑ-茄碱的测定方法主要有称重法[8]、比色法[9]、薄层色谱扫描法[10]、酶联免疫法[11]和高效液相色谱法[12]等。其中称重法误差大，比色法、薄层色谱扫描法和酶联免疫法前处理过程比较复杂，且比色法和薄层色谱扫描法也不能对ɑ-茄碱进行准确的定量分析。高效液相色谱法成本又较高。近年来，化学发光分析法以其仪器简单、灵敏度高、操作方便等优点被应用到食品、环境监测和药物分析等领域[13-15]。用流动注射化学发光法测定龙葵素中的ɑ-茄碱的研究未见报道。本实验旨在研究ɑ-茄碱对鲁米诺-铁氰化钾发光体系发光强度的影响作用，同时，建立一种简单、快速、灵敏度高的化学发光体系，用于饮用水中ɑ-茄碱突然变化的快速监测和早期安全预警。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲁米诺储备液（0.01mol/L） 称取0.4430g鲁米诺（Sigma公司），用25mL 1mol/L氢氧化钠溶液溶解并定容至250mL棕色容量瓶中，避光放置1周后使用；铁氰化钾储备液（0.01mol/L） 称取0.3295g铁氰化钾，用少量二次水溶解，定容至100mL棕色容量瓶中，避光储存备用；ɑ-solanine 上海Sigma试剂公司；硫酸分析纯，广州化学试剂厂；氢氧化钠 分析纯，天津市大茂化学试剂厂；实验用水 双蒸水。

IFIS-C型流动注射化学发光仪、RFL-1型超微弱化学发光/生物发光检测仪 西安瑞迈电子科技有限公司；RF-5301荧光分光光度计 日本岛津公司；PHS-3C数字式pH计 上海精密科学仪器有限公司；EL104电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；0.1～1mL、0～50μL微量移液枪 德国BRAND公司。

1.2 实验方法

1.2.1 进样方法 按图1所示连接流动注射化学发光分析路径，a、b、c 3个流通管道分别插入ɑ-茄碱溶液（样品）、铁氰化钾溶液、鲁米诺溶液。鲁米诺溶液首先与铁氰化钾溶液经三通阀V混合反应，再和ɑ-茄碱溶液混合，进入反应池F反应产生化学发光信号，由光电倍增管（PMT检测），信号经放大器放大，进入计算机处理。据此得到最大且重复性较好的发光信号。

图1 流动注射化学发光法流程示意图Fig.1 Schematic diagram of flow-injection chemiluminescence system

1.2.2 荧光光谱分析 应用岛津RF-5301PC荧光光度计分别对鲁米诺、鲁米诺-铁氰化钾混合液、鲁米诺-铁氰化钾-ɑ-茄碱混合液进行荧光光谱分析。

1.2.3 单因素的选取和实验 选取影响化学发光强度的四个因素：鲁米诺浓度、铁氰化钾浓度、鲁米诺溶液pH、ɑ-茄碱分析液的pH进行单因素实验，考察各因素对相对化学发光强度的影响。

1.2.4 正交实验设计 根据单因素实验结果，将对实验结果有影响的四个因素，采用L9（34）正交表进行正交实验设计（见表1）。

2 结果与分析

2.1 各溶液发射光谱图

从图2中可以看出：鲁米诺的最强发射波长点在425nm处，发光体是3-氨基邻苯二甲酸根离子的激发态。加入铁氰化钾后，发射波长仍然在425nm处且相对荧光强度有明显增强，但发光体仍是3-氨基邻苯二甲酸根离子的激发态。加入ɑ-茄碱后，ɑ-茄碱首先与铁氰化钾发生配位反应，反应的络合物抑制了鲁米诺-铁氰化钾的荧光强度。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

图2 发射光谱图Fig.2 Fluorescence spectrum

2.2 单因素对化学强度的影响

2.2.1 鲁米诺浓度的选择 鲁米诺作为发光试剂，其浓度大小直接影响化学发光强度。本研究考察了在5.0×10-5～1.0×10-3mol/L范围内鲁米诺溶液浓度与化学发光强度的关系见图3。随着鲁米诺溶液浓度的增大，反应体系的化学发光强度也不断增大。基于实验成本和环境污染等方面的综合考虑，鲁米诺初选浓度为2.0×10-4mol/L。

图3 鲁米诺浓度对相对化学发光强度的影响Fig.3 Effect of luminol concentration on relative luminescence intensity

2.2.2 铁氰化钾浓度的选择 铁氰化钾是该发光体系的氧化剂，其浓度在一定范围内影响化学发光强度。在5.0×10-5～1.0×10-3mol/L范围内铁氰化钾浓度与化学发光强度的关系见图4。铁氰化钾溶液浓度为4.0×10-4mol/L时灵敏度较高，相对化学发光强度较理想。因此，选择铁氰化钾最佳浓度为4.0×10-4mol/L。

2.2.3 ɑ-茄碱分析液的pH的选择 ɑ-茄碱分析液的pH对体系发光强度影响见图5。当pH为4时，体系化学发光强度最强，这是由于鲁米诺的化学发光反应要求在碱性介质中进行，而在碱性介质中ɑ-茄碱会沉淀，因此必须保证足够的酸度，以保证ɑ-茄碱的稳定存在，因此初步选择ɑ-茄碱分析液的pH为4。

图4 铁氰化钾对相对化学发光强度的影响Fig.4 Effect of K3Fe（CN）6concentration on relative luminescence intensity

图5 ɑ-茄碱溶液pH对相对化学发光强度的影响Fig.5 Effect of pH value of ɑ-solanine concentration on relative luminescence intensity

2.2.4 缓冲液pH的选择 缓冲液pH对体系发光强度影响见图6。当鲁米诺pH为12.8时，体系化学发光信号最强，因此，初选鲁米诺缓冲液pH为12.8。

图6 鲁米诺溶液pH对相对化学发光强度的影响Fig.6 Effcet of pH of luminal solution onrelative luminescence intensity

2.3 多因素组合对化学发光强度的影响

根据以上单因素实验得出的最佳反应条件，设计了一个四因素三水平的正交实验（表2）以确定发光体系的最佳反应条件。

实验结果见表2，各因素影响化学发光程度大小顺序为A＞D＞B＞C，推出体系最佳优化组合为A3B2C1D2，即鲁米诺分析液浓度为4.0×10-4mol/L，铁氰化钾浓度为4.0×10-4mol/L，ɑ-茄碱分析液pH为3，缓冲液pH为12.8，验证实验得其相对化学发光强度为14437.5。

2.4 标准曲线、精密度及检出限

在上述选定的最佳实验条件下，化学发光强度在8.0×10-4～9.0×10-3mg/mL，1.0×10-2～1.0×10-1mg/mL内呈良好的线性关系。其回归方程如表4。对2×10-3mg/mL的ɑ-solanine进行11次平行测定，其相对标准偏差为2.1%。根据IUPAC建议，计算出检出限为6.09×10-5mg/mL。

表2 正交实验方案及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and test results

表3 正交实验方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal test results

表4 校准曲线的线性范围及回归方程Table 4 Linear range and regression equation of the calibration curves

2.5 干扰实验

在最佳优化实验条件下，研究了可能的共存物质对ɑ-茄碱测定的影响，当ɑ-茄碱溶液浓度为2×10-3mg/mL时，干扰允许误差为±5.0%时，实验结果表明，1000倍的K+、Na+、NO3-、Fe3+、Cl-，200倍的Mg2+、Ca2+、Al3+等常见离子无干扰，1倍的AS3+、Pb2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Cr3+、Hg+等会催化鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系，对测定产生干扰，方法选择性不好。为了避免金属离子的干扰，可以加入0.5%（v/v）的5.0×10-4mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）作为掩蔽剂消除金属离子的干扰。

2.6 样品分析及回收率实验结果

表5 样品中茄碱含量测定结果Table 5 Results of ɑ-solanine content in water

在最佳优化实验条件下，以实验室自来水、宿舍自来水作为水样测定ɑ-茄碱含量。然后采取标样加入法加入2×10-3mg/mL ɑ-茄碱对其进行测定，结果如表5所示。

3 结论

ɑ-茄碱对鲁米诺-铁氰化钾化学发光体系发光强度有明显的抑制作用。据此建立了在最佳条件下测定ɑ-茄碱的分析方法，实现了流动注射化学发光法测定饮用水中ɑ-茄碱的变化情况，该方法的检出限达6.09×10-5mg/mL，线性范围是8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL。与常规方法相比，该方法具有仪器简单、快速、自动化程度高以及即时预警等特点，可应用于饮用水中ɑ-茄碱快速突变的检测。

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Determination of ɑ-solanine in drinking water by flow-injection chemiluminescence system of luminol and potassium ferricyanide

ZHU Ding-bo，MA Qiang，YAN Ting，TENG Jiu-wei，TANG Shu-ze*
（Food Science and Technology Department，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

In order to establish a new method for rapid determination of ɑ -solanine， a flow-injection chemiluminescence（FI-CL） system of luminol and potassium ferricyanide was developed.Results indicated that the CL reaction betweeen luminol and potassium ferricyanide was significantly reduced by ɑ-solanine.An excellent linear range for ɑ-solanine determination was 8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL under the optimal condition.The limit detection of ɑ-solanine was 6.09×10-5mg/mL and relative standard deviation for the determination was 2.1%（n=11）.This method showed the advantages of simple operation，high degree of automation，easy to run on-line and real-time warning detection，and could be used as a rapid method for determination of ɑ-solanine in drinking water.

luminol；potassium ferricyanide；chemiluminescence；ɑ-solanine

TS201.6

A

1002-0306（2012）22-0084-04

2012－05－28 * 通讯联系人

朱定波（1986-），男，硕士在读研究生，研究方向：食品安全预警。

广东省食品安全卫生应急技术中心（粤科函社字[2011]733号）。