复合固定化酸性脲酶酶膜的制备及应用

吕园园，田亚平

（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122)

复合固定化酸性脲酶酶膜的制备及应用

吕园园，田亚平*

（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122)

用复合固定化方法将酸性脲酶固定在壳聚糖-明胶膜上，探讨了固定化的条件和性质、稳定剂对固定化酶膜的作用、固定化酶膜反应器在黄酒中的应用。结果表明：采用质量浓度为1.0%的壳聚糖和0.75%的明胶混合制备含0.579U/cm2酸性脲酶的酶膜，储存半衰期可达81d;在固定化酶膜中加入10%的甘油，在不影响成膜状态和强度的前提下，固定化酶活回收率由66.4%提高到82.25%，储存半衰期可达100d;将16cm2的酶膜采用间歇振荡法分批处理30mL黄酒12h，在尿素去除率仍达50%以上的前提下，可连续处理8批黄酒，较未加稳定剂的提高2个使用批次，酶膜的使用半衰期有明显提高;将约为500cm2的酶膜以卷式膜形式做成酶膜反应器，以0.5mL/min的流速连续处理2L黄酒时，70h后，尿素去除率仍可达50%，且基本未改变黄酒的风味，并最终达到降低氨基甲酸乙酯（EC)的目的。

固定化酶膜，稳定剂，酶膜反应器，氨基甲酸乙酯（EC)

近年来，固定化酶技术在食品、医院、环境保护和化学工业中[1]的飞速发展得到了科学界和产业界的高度重视。固定化酶与游离酶相比具有许多优点，如适用于多酶反应体系;易于和底物、产物分离;酶的稳定性增加，可以重复使用，使成本降低;可用于构造酶反应器，反复分批反应和装柱连续反应等[2]。但是，酶在固定化的过程中失去活力是限制固定化酶广泛应用的关键因素[3]，采用在酶固定化过程中添加一定浓度的稳定剂，对酶、蛋白等生物活性物质起稳定保护作用，提高稳定性，降低原酶使用量，对酶的工业化生产和应用具有重要的现实意义和经济价值[4]。以壳聚糖、明胶为载体材料，采用吸附包埋复合制膜技术，将酶固定在膜上制成酶膜，利用其极高的比表面积，提高固定化酶的载酶量，且在酶膜中加入对酸性脲酶有保护作用的稳定剂，可大大延长酶膜的使用寿命。传统的固定化方法虽然具有自身的优势，但同时都存在难以克服的缺陷。为了克服各种固定化方法的缺陷与不足，获得具有高固定化强度和高微生物活性的固定化微生物系统，可以采用两法结合或是三法结合的改进方法。复合固定化技术的方法多种多样，主要有吸附一包埋法、包埋一交联法、聚集一交联法以及三法合用的吸附一包埋一交联法等。实验中采用吸附-包埋法，稳定性好，回收率高，具有不可比拟的优越性。固定化酶膜能够将酶的催化特性和膜的优良分离性能有机地结合起来，从而构成酶膜反应器，它可使化学反应和产品分离同时进行，有效地加速反应，提高转化率。因此，酶膜反应器已被广泛应用于化工、制药、环保、食品工业等领域[5-6]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸性脲酶 从本实验所筛菌株中分离纯化所得;壳聚糖 山东奥康生物科技有限公司，脱乙酰度90%;明胶 上海化学试剂厂，色谱纯;戊二醛 国药集团化学试剂有限公司，浓度25%;二乙酰一肟、硫代氨基脲 上海化学试剂厂，色谱纯;蔗糖、甘油、硝基苯、戊烷、二氯甲烷、无水硫酸钠 国药集团化学试剂有限公司，色谱纯。

HH-系列数显恒温水浴锅、85-2A数显测速恒温磁力搅拌器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;电子天平 上海菁海仪器有限公司;722光栅分光光度计 上海第三分析仪器厂;层析柱35× 200mm 上海锦华层析设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化酸性脲酶酶膜的制作 将壳聚糖和明胶按一定比例溶于100mL 1%的乙酸中，加入适量酸性脲酶，置于磁力搅拌器上，搅匀脱泡后，双层纱布过滤，均匀倾倒在光滑的玻璃板上，37℃下脱水成膜，该膜用缓冲液浸泡后剥离。

将制好的膜放于重蒸水中溶涨24h，剪成大小均匀的方块，浸泡在戊二醛溶液中进行交联反应，一定时间后，用去离子水洗涤以除去未反应的戊二醛，至无游离戊二醛存在为止（紫外280nm检测吸光度低于0.01)[7]，所得固定化膜贮存在4℃冰箱内，备用。

1.2.2 酸性脲酶保护剂的选择

1.2.2.1 酶液与稳定剂贮液的配制[8]稳定剂均用pH5.0的柠檬酸缓冲液配制，其中糖类（葡萄糖、蔗糖)配制为1、2、3、4、5g/L不同浓度，多元醇类甘油配制为2%、4%、6%、8%和10%（体积分数)浓度，山梨醇配制l、2、3、4、5g/L，氯化钠配制10、20、30、40、50mmol/L，4℃储存备用。

1.2.2.2 最佳稳定剂的选择 将酶液和几种稳定剂贮液分别以1∶100的体积混合。将加有不同种类、不同浓度稳定剂的酶液在70℃水浴下处理3h后，立即用冰水冷却，取混合液一定体积稀释10倍，按照酸性脲酶酶活测定方法，测其酶活。以不加稳定剂的酶液作对照，分别计算酶活保留率，考察每种稳定剂具有最强保护作用的最适浓度。

1.2.3 稳定剂对固定化酸性脲酶酶膜的作用

1.2.3.1 加入稳定剂后固定化酸性脲酶酶膜的使用半衰期 将大小为16cm2的未加稳定剂的酶膜和加入稳定剂的酶膜分别作用于30mL黄酒溶液中，37℃下100r/min摇床反应12h为一个批次，移出反应液，取样测定酶活力。重新加入新鲜的溶液，再测固定化酶活力，如此反复操作并测定固定化酸性脲酶酶膜的使用半衰期。

1.2.3.2 固定化酸性脲酶酶膜的储存稳定性 将加有稳定剂的酶膜和未加稳定剂的酶膜分别置于pH5.0的柠檬酸缓冲液中，常温下放置，以初始酶膜的酶活作对照，分别计算酶活保留率。

1.2.4 固定化酸性脲酶酶膜在生物反应器上的应用

将含有稳定剂的固定化酸性脲酶酶膜与尼龙丝网做成卷轴模式，装入直径为35mm，长度为200mm的层析柱中，用恒流泵泵入黄酒酒样，停留反应后，取样测定黄酒中尿素以及风味物质含量。

1.2.5 测定方法

1.2.5.1 游离酶酶活测定 采用靛酚蓝反应（Berthelot reaction)比色法[9]。

1.2.5.2 固定化膜酶活测定 取1cm2膜浸入一定体积柠檬酸缓冲液配制的pH5.0的3%尿素溶液中，在37℃恒温水浴箱中保温30min后，过滤取其滤液，以下操作与游离酶活力测定相同。

1.2.5.3 尿素去除率的测定方法 采用二乙酰一肟法[10]。

1.2.5.4 黄酒的风味物质测定 采用气相色谱-质谱联用法（GC-MS)。

1.2.5.5 黄酒中的EC含量的测定 取一定量待测样品（约20mL黄酒)放入分液漏斗中，加入0.2mL 10mg/L内标溶液（硝基苯)，逐渐加入氯化钠摇动2～3min（至少摇动200次)，至氯化钠饱和。用等体积的戊烷或己烷萃取，去除样品中的非极性杂质，保留水相再加入15mL二氯甲烷振荡3min（至少摇动200次)，静置分层，放去有机相。水相再分别用10mL的二氯甲烷萃取2次。合并有机相，用装有10g无水硫酸钠的玻璃柱脱水（可以直接加入有机相)，旋转蒸发或者真空干燥浓缩，二氯甲烷或乙酸乙酯洗出浓缩液，氮吹浓缩至0.2mL左右，进样，用气相色谱-质谱联用法（GC-MS)。

2 结果与讨论

2.1 固定化酸性脲酶酶膜的制备及性质

经过一系列优化实验可知：采用质量浓度分别为1.0%、0.75%的壳聚糖、明胶制膜，用浓度为0.02%的戊二醛交联，最适固定化时间为2h，固定化回收率为69.1%。与游离酶相比，固定化酶有更宽的pH和温度适用范围，储存半衰期长达81d，重复测定10次后其活力仍有91%。

2.2 稳定剂对酸性脲酶的影响

按1.2.2中所描述的方法分别测定甘油、山梨醇、氯化钠、蔗糖、乳糖提高酸性脲酶稳定性的最适浓度及酶活保留率，结果见表1。

由表1中结果可知，甘油对酸性脲酶酶活有很好的保护作用;山梨醇在70℃水浴处理时不稳定，理化特性发生了改变，故而对酶活出现一定的抑制作用;NaCl对酸性脲酶有微弱的保护作用;蔗糖和乳糖均可对酸性脲酶起到保护作用，但是乳糖作为稳定剂时，酸性脲酶酶液在后期储存过程中发生蛋白质褐变反应，导致蛋白发生变质，致使酶活降低。

表1 不同稳定剂对酸性脲酶的影响Table 1 Effect of different stabilizers on acid urease

2.3 稳定剂对固定化酸性脲酶酶膜的作用

2.3.1 固定化酸性脲酶酶膜稳定剂的选择 根据酸性脲酶稳定剂的选择，以及固定化材料的选择和应用的综合考虑，选择甘油和蔗糖两种稳定剂进行考察研究。

表2 不同浓度甘油对固定化酸性脲酶酶膜稳定性的影响Table 2 Effect of different concentration of glycerol on stability of immobilized acid urease enzyme membrane

表3 不同浓度蔗糖对固定化酸性脲酶酶膜稳定性的影响Table 3 Effect of different concentration of sucrose on stability of immobilized acid urease enzyme membrane

从表2、表3可见，甘油和蔗糖在酸性脲酶固定化过程中，均起到很好的保护作用。加入甘油为稳定剂，当甘油浓度为10%时，单位面积酶活是未加保护剂的2.62倍。加入蔗糖为稳定剂，当蔗糖浓度为3g/L时，单位面积酶活是未加保护剂的2.27倍。当两者混合使用，最佳比例为甘油10%、蔗糖3g/L，此时单位面积酶活为0.607U/cm2，比单独加15%的甘油为稳定剂提高不大，从经济角度考虑选用10%甘油作为酸性脲酶酶膜的最佳稳定剂。

2.3.2 固定化酸性脲酶酶膜的回收率测定 由表4结果可知，未加稳定剂的固定化酸性脲酶酶膜最适加酶量是2mL酶/100mL混合液，此时酶活回收率为66.40%，加入15%的甘油作为稳定剂，单位面积酶活提高，且酶活回收率达到82.25%，大大提高了酶的利用率。

表4 固定化酸性脲酶酶膜回收率Table 4 The activity recovery rates of immobilized acid urease enzyme membrane

2.3.3 固定化酸性脲酶酶膜的使用半衰期 实验结果表明，加入稳定剂的酶膜处理黄酒酒样，可连续使用8个批次，酶活降低一半;而未加稳定剂的酶膜仅能重复利用6次，即使酶活降低一半，说明该稳定剂对固定化酸性脲酶酶膜有一定的保护作用。

图1 固定化酸性脲酶酶膜的使用半衰期Fig.1 Thehalf-livesofimmobilizedacidureaseenzymemembrane

2.3.4 固定化酸性脲酶酶膜储存稳定性的影响 将原酶液、固定化酸性脲酶酶膜以及加入稳定剂的酶膜分别放于4℃冰箱中，20d测定一次酶活，计算其酶活保留率，从而比较酶在不同状态下的储存稳定性。

表5 不同状态酸性脲酶的储存稳定性Table 5 The stability of acid urease at different conditions

介于酶活回收率不同，初始酶活不同，为了更加方便考察储存稳定性，改变加酶量，使三种不同状态下酶的酶活初始值相同，于同等条件下考察储存稳定性，由表5中结果可知，60d后固定化酸性脲酶的酶活保留率较游离酶提高2.12倍，加入保护剂的提高了2.54倍。

2.4 固定化酸性脲酶酶膜在生物反应器上的应用

2.4.1 酶膜生物反应器的作用 按1.2.4的方法，在层析柱中加入面积约为500cm2的酶膜，调节横流泵使黄酒流速为0.5mL/min，每个批次处理黄酒样为250mL，连续循环两次后换新的酒样，同时取样检测已处理黄酒的尿素去除率。

图2 不同处理批次下黄酒的尿素去除率Fig.2 The urea removal rate of rice wine at different batches

结果表明：此生物膜反应器连续处理2L黄酒时尿素去除率仍为50%，说明此酶膜反应器具有较好的应用效果，能使酶膜连续使用，从而达到降低酶用量和成本的效果。

2.4.2 用固定化酸性脲酶酶膜处理过的黄酒中EC含量变化 用固定化酸性脲酶酶膜处理未煎过的黄酒，85℃下煎酒30min，考察EC含量的变化。

表6 煎酒前后黄酒中EC变化Table 6 The changes of EC of rice wine before and after heating

由表6可知，固定化酸性脲酶酶膜处理前后，黄酒中尿素去除率为54.8%，EC含量降低率为55.6%。说明固定化酸性脲酶酶膜不仅能分解产生EC的前提物质尿素，从而使煎酒后产生的尿素EC含量降低，而且自身可能还对EC具有一定的吸附作用。

2.4.3 固定化处理后黄酒风味分析 处理前的黄酒中含有51种风味物质，其中9种酸类，11种醇类，7种醛类，24种酯类;处理后的黄酒中含有52种风味物质，其中9种酸类，11种醇类，10种醛类，22种酯类。从色谱分析图中可知，用固定化酸性脲酶酶膜处理后，醛类物质增加三种，分别是2-甲基-2-丁烯醛、壬醛、5-甲基呋喃醛;减少的两种酯类为：对羟基苯甲酸丁酯、油酸乙酯。变化的几种物质均含量极少，且不是影响黄酒风味的主要物质。此外液相色谱处理过程中也略有误差，由此可知，固定化酶膜反应器处理之后，对黄酒的风味物质没有太大影响，故而用此方法固定化酸性脲酶处理黄酒是一种很好的选择。

图3 原酒的风味图谱Fig.3 Spectrogram of original rice wine flavour

图4 酶膜反应器处理后黄酒的风味图谱Fig.4 Spectrogram of rice wine flavour after treatment

3 结论

向黄酒中添加酸性脲酶可以降低尿素含量，但游离酸性脲酶在酒中反应后酶难以分离回收，无法重复使用。本实验将酸性脲酶固定于壳聚糖-明胶膜上，且在膜中加入保护剂，一方面使酶活收率由66.40%提高到82.25%;另一方面大大提高了酶的利用次数，存储周期增长。

此外，将酶膜以卷轴膜形式做成反应器，在黄酒生产中应用，只需在煎酒之前将原酒通过反应器，即可大大降低尿素含量，连续处理2L黄酒时尿素去除率仍为50%，处理方便，基本不改变酿造酒的工艺条件和风味，最终使EC含量降低55.6%，具有不可比拟的优越性。

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Preparation and application of composite immobilized acid urease enzyme membrane

LV Yuan-yuan，TIAN Ya-ping*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The acid urease was fixed on chitosan-gelatin film by multi-technology，then the conditions and nature of immobilization，the stabilizer of membrane，immobilized enzyme membrane reactor were discussed.The results showed that：the film which containing 0.579U/cm2acid urease was made by 1.0%chitosan and 0.75% gelatin，the thermal stability and pH stability were improved，the half-lives was 81 days.Added 10%glycerin to the immobilized enzyme membrane，in the premise of not affecting the status and strength of the film，the activity recovery rate was increased from 66.4%to 82.25%，the half-lives was reached 100 days.Adding 16cm2size of the enzyme membrane to 30mL rice wine，12h intermittent oscillation，which can consecutively deal with 8 batches rice wine before the activity reduced by half，improved two batches comparing with adding no stabilizers and the half-lives of enzyme membrane significantly increased.An enzyme membrane reactor was made of 500cm2membrane in the form of roll film.Rice wine flowed at the rate of 0.5mL/min，continuously dealled with 2L of wine，the urea removal rate was still 50%without changing the wine flavor，and the carcinogenic substances-ethyl carbamate（EC)was reduced.

immobilized enzyme membrane;stabilizer;enzyme membrane reactor;ethyl carbamate（EC)

TS201.2

A

1002-0306（2012)07-0177-04

2011－05－31 *通讯联系人

吕园园（1987-)，女，硕士研究生，研究方向：发酵工程。

国家“十一五”科技支撑计划项目（2007BA K36802)。