UPLC-MS/MS检测柑桔不同组织中的柠檬苦素

江 海，李新生，*，吴三桥，刘 新，韩 豪，高 玥，彭 浩

（1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723000；2.陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中 723000）

UPLC-MS/MS检测柑桔不同组织中的柠檬苦素

江 海1，2，李新生1，2，*，吴三桥1，刘 新1，韩 豪1，高 玥1，彭 浩1，2

（1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723000；2.陕西省资源生物重点实验室，陕西汉中 723000）

目的：检测柑桔果皮、果肉、桔络以及桔籽中柠檬苦素的含量，分析柑桔加工中苦味物质的来源。方法：用UPLC－MS/MS法检测，色谱柱：waters ACQUITY BEH C18（50mm×2.5mm，1.9μm）；流动相：A为乙腈，B为纯水，采用梯度洗脱：A：10%（0min）－50%（3min）－10%（4min）－10%（5min）；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：5μL；检测时间：5min；正离子模式（ESI+）质谱检测器：柠檬苦素母离子m/z=471.1，子离子m/z=425.3，m/z=161.1。结果：在检测色谱－质谱条件下柠檬苦素检测效果良好，柑桔中柠檬苦素含量依次为：桔籽＞桔络＞桔皮＞桔肉。结论：柑桔加工中尽量选用无籽品种，采用手工剥皮，同时剔除桔络能有效地避免产品的苦味。

UPLC－MS/MS，测定分析，柑桔，组织，柠檬苦素

柑桔是世界第一大水果，在全球140个国家和地区均有种植，全球柑桔常年总产量为6000～10000万t，其中柑桔产量居世界前3位的分别为巴西、美国和中国[1－3]。2007年我国柑桔种植面积达191×104hm2，约占世界柑桔种植总面积的25%，产量达2059×104t，占世界总产量的17%，我国柑桔种植面积和产量均居世界首位[4]。柑桔是果汁生产的主要原料，柑桔汁产量约占世界果汁总量的67%[5]，但我国缺乏柑桔加工优势企业，柑桔多为鲜食，柑桔加工率不足10%，常有柑桔丰产滞销现象。柑桔滞销已成困扰柑桔业发展的难题。解决我国柑桔滞销问题，最可行的办法就是发展柑桔深加工。但是，柑桔加工（特别是果汁生产）过程中所出现的苦味问题成为制约我国柑桔加工业发展的瓶颈。柑桔苦味主要来自柠檬苦素类（Limonins）和柚皮苷类物质（Naringin）。柠檬苦素类似物广泛存在于柑桔属植物中，其中含量的高低直接影响柑桔的品质。柑桔通常鲜食无苦味，但经榨汁、杀菌等加工处理后就表现出苦味，这种现象称之为“延迟苦味”。据报道，柑桔汁出现“延迟苦味”的原因主要是在酸性条件和柠檬苦素D环内酯水解酶的催化下，果实中所存在的非苦味的柠檬苦素A-环内酯转变成了具有强烈苦味的柠檬苦素[6-10]。柠檬苦素含量的高低直接影响柑桔及其产品的品质，测定柠檬苦素的含量可用于控制柑桔及其相关产品的质量。已报道的柠檬苦素检测方法很多，主要有Davis法、分光光度法、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）等[11-14]，但因柠檬苦素类似物配糖体极性强，在提取液中常与许多杂质共存，因而对其检测及纯化都很困难，多数检测方法效果不佳。这里采用UPLC-MS/MS检测了柑桔果皮、果肉、桔络以及桔籽不同组织中柠檬苦素的含量，分析柑桔加工中苦味物质的来源，旨在为柑桔的深加工提供一些参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柑桔样品 2010年11月采于陕西省城固县郭家山泛亚柑桔种植基地；桔皮样品 手工剥皮，经烘箱60℃烘干、粉粹，过60目分样筛，备用；桔籽样品 从桔子中剔除桔籽，烘箱60℃烘干、粉粹，过60目分样筛，备用；桔络样品 桔瓤外白色的网状筋络通常被称之桔络，手工撕下桔络，烘箱60℃烘干、粉粹，过60目分样筛，备用；桔肉样品 将去皮，去籽，剔除桔络的柑桔60℃烘干，粉碎，备用；柠檬苦素 纯度99.8%，天津一方科技有限公司；乙腈 色谱纯，Burdick and Jackson公司；甲醇、石油醚、丙酮 分析纯，天津市登峰化学试剂厂；超纯水 娃哈哈广元纯水公司。

ACQUITY UPLC型超高效液相色谱、ACQUITY TQD型三重四级杆质谱仪配MassLynxTMMS软件 美国Waters公司；水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；SHIMADZU AUW 220D型十万分之一电子天平、SHIMADZU AUY220型万分之一电子天平 日本岛津公司；SK 1200H型超声波清洗机 无锡市兴邦基业电子有限公司；BM 252C型榨汁机 美的公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 Waters ACQUITY BEH C18（50mm× 2.5mm，1.9μm），柱温40℃，流速0.3m L/m in，进样5μL。流动相为：水：乙腈梯度洗脱，乙腈梯度为10%（0m in）-50%（3m in）-10%（4m in）-10%（5m in）。

1.2.2 质谱条件 毛细管电压3.2kV，锥孔电压40kV，离子源温度110℃，脱溶剂气温度400℃，锥孔气流量50L/h，脱溶剂气流量800L/h。离子化模式为大气压电喷雾离子源正离子模式（ESI+），碰撞池电压（collision V）30V，碰撞氩气流速0.14m L/m in。采用多反应监测（MRM），柠檬苦素母离子m/z=471.1，子离子m/z=425.3、m/z=161.1。

1.2.3 标准品溶液的制备 精密称取柠檬苦素标准品2.85mg，用10m L乙腈溶解，超纯水定容至25.0m L。制得柠檬苦素114mg/L的标准对照母液。

1.2.4 标准曲线制备 取柠檬苦素标准母液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0m L，用50%的乙腈水溶液定容于10m L容量瓶。得到柠檬苦素0.57、1.14、5.70、11.40、22.80mg/L的标准工作溶液。在仪器设定的色谱-质谱条件下，通过0.22μm滤膜过滤，进标准梯度样品各5μL，以柠檬苦素母离子m/z=471.1进行选择，m/z=425.3为定性离子，m/z=161.1为定量离子。

1.2.5 定量限实验 将柠檬苦素0.57μg/m L的标准溶液逐级稀释，在液相质谱分析条件下进样分析，以S/N=10，确定柠檬苦素的定量限。

1.2.6 样品溶液制备 称取干燥的桔皮、桔籽、桔络、桔肉各3.0g于250m L的圆底烧瓶中，量取50.0m L石油醚（30~60℃）于40℃超声脱脂30min，抽滤，弃去滤液；向滤渣中加入50.0m L丙酮，40°C超声提取30m in，过滤；滤液挥干，用50%乙腈-水（V∶V）溶液定容至50.0m L。过0.22μm有机微孔滤膜后在设定的液相-质谱条件下检测。

2 结果与分析

2.1 线性范围

标样色谱图见图1。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标拟合标准工作曲线，柠檬苦素线性回归方程为：Y=62.7883X+11.245，r=0.99954。该检测条件下，柠檬苦素在2.85～114ng之间线性关系良好。

图1 柠檬苦素标准品色谱-质谱图Fig.1 The limonin’s chromatogram of standard

2.2 定量限确定

经实验，在液相-质谱分析条件下进样分析得到S/N=10，计算得柠檬苦素的定量检测限为2.8ng/m L。

2.3 重复性实验结果

取桔籽样品，按1.2.6方法制备样品，在色谱-质谱条件下平行测定5次，每次进样5μL，测定柠檬苦素的峰面积，计算相对标准偏差。其中柠檬苦素的峰面积分别为850.2、845.6、878.3、866.7、835.5，RSD=2.00%（n=5），结果表明方法的重复性良好。

2.4 稳定性实验结果

取桔籽样品，按1.2.6方法制备，在色谱-质谱条件下，分别在0.5、1、6、12、24h进样5μL检测柠檬苦素的峰面积，分别为866.4、895.3、875.8、832.9、885.3，计算相对标准偏差，求得RSD为2.75%（n=5）。结果表明在该方法条件下，柠檬苦素稳定。

2.5 回收率实验结果

精密量取已测定柠檬苦素为218.49mg/kg的桔肉3.0g，加入5.70mg柠檬苦素标准物质，按1.2.6方法制备样品条件平行制备3份，在色谱-质谱条件下测定，计算柠檬苦素的回收率，结果如表1所示。

表1 回收率测定结果Table 1 Themeasurement results of recovery

从表1可知，柠檬苦素的平均回收率为99.53%，RSD=2.91%（n=3）。同样的方法计算桔籽的平均回收率为99.32%，RSD=2.15%（n=3）；桔络的平均回收率为101.54，RSD=2.54%（n=3）；桔皮的平均回收率为100.85%；RSD=3.14%（n=3）。结果表明方法准确可靠。

2.6 柑桔中不同组织柠檬苦素质量浓度的测定结果

依样品制备方法和测定条件，对桔籽、桔络、桔肉、桔皮样品中的柠檬苦素质量浓度测定，色谱-质谱图见图2，结果见表2。

图2 桔籽中柠檬苦素色谱-质谱图Fig.2 The limonin’s chromatogram of citrus seeds

表2 样品测定结果（n=3）Table 2 Themeasurement results of samples

柑桔中各个部分均含有柠檬苦素，其中桔籽、桔络中柠檬苦素含量较高，桔肉中含量最低。柑桔的含水率在95%左右，将桔肉中柠檬苦素含量换算为柑桔汁中的柠檬苦素含量大概为10mg/kg左右，与直接利用桔子汁进行检测结果基本相吻合。

3 结论与讨论

在实验分析过程中，就实验样品的处理进行了多次实验。柠檬苦素在桔肉中含量较低，为了与桔籽、桔络、桔皮检测干燥样品相比较，我们采用将桔肉烘干的办法。但桔肉检测的最终结果通过含水率换算后，比直接采用桔汁检测大15%左右，这可能与桔子汁的后苦效应有关，同时也与桔肉样品处理步骤增多，增加结果检测误差有关。如要测定桔汁的柠檬苦素含量，最好直接采用桔汁提取后检测。在色谱条件的选择上曾使用HPLC结合VWD（紫外-可见吸收）检测，因检测波长在203nm，分析基线噪音很大，结果不理想，同时HPLC分析时间较长。采用UPLC后，分离效率明显提高；采用DAD（二极管阵列）检测，检测效果较VWD好，但检出限较高，重复性较差，对低含量柠檬苦素无法检测。采用UPLC-MS/MS分析，分离效果好，检出限低，实验结果重复性、稳定性良好，为实验所选择。柑桔中的柠檬苦素主要存在于桔籽和桔络中，柑桔皮除含有柠檬苦素，还含有柚皮苷类致苦物质，在桔汁加工中清除桔皮，桔籽和桔络能有效避免苦味物质的产生。但在实际工业加工中，桔子去皮可通过工艺改进实现，去籽和去桔络则难度太大，暂无有效方法。鉴于此，建议桔汁加工原料尽量选用无籽和桔络较少的柑桔品种。为利于柑桔加工，柑桔种植基地可进行无籽、少桔络柑桔品种的育种和推广。

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Detection of limonin in citrus with different tissue by UPLC-MS/MS

JIANG Hai1，2，LIXin-sheng1，2，*，WU San-qiao1，LIU Xin1，HAN Hao1，GAO Yue1，PENG Hao1，2
（1.School of Biological Science&Engineering，ShaanxiUniversity of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Shaanxi Key Laboratory of Resource Biology，Hanzhong 723000，China）

Ob jec tive：Determ ined the contents of Limonin in citrus peel，citrus flesh，d ried tangerine fibre and citrus seed.Analysis of the source of citrus bitterness substances in p rocessing.Methods：The column was waters ACQUITY BEH C18（50mm×2.5mm，1.9μm）by UPLC-MS/MS，mobile phase：using g rad ient elution，A was acetonitrile and B was water，A：10%（0m in）-50%（3m in）-10%（4m in）-10%（5m in），the velocity of flow was 0.3m L/m in，column temperature was 40℃，injection quantity was 5μL，detection time was 5m in，ESI（+）scan，the limonin’s parents were m/z=471.1，daughter were m/z=425.3 and m/z=161.1.Results：Limonin could be detected in the chromatog raphy-mass spectrum cond itions.The limonin contents discretion order in citrus was citrus seed>d ried tangerine fibre>citrus peel>citrus flesh.Conc lusion：In citrus p rocessing，tried to choose seed less varieties.Using manualskinning，and elim inate d ried tangerine fibre could avoid the bitter.

UPLC-MS/MS；determ ination；c trus；tissue；limonin

TS255.1

A

1002－0306（2012）14－0087－03

2011－12－13 *通讯联系人

江海（1977－），男，硕士，实验师，研究方向：生物资源开发利用。

陕西省教育厅科研项目（2011GJ21，11JS033）；陕西理工学院科研资助项目（SLG0814）。