马铃薯淀粉废水中蛋白质的提取研究

任琼琼，陈丽清，韩佳冬，张宇昊，2，*，马 良，2

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716）

马铃薯淀粉废水中蛋白质的提取研究

任琼琼1，陈丽清1，韩佳冬1，张宇昊1，2，*，马 良1，2

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716）

实验采用碱提酸沉法与超滤相结合从马铃薯淀粉废水中提取蛋白质。通过单因素实验和响应曲面法优化碱提酸沉工艺，结果表明，碱提酸沉法提取马铃薯淀粉废水蛋白质的最佳工艺参数为：碱提pH9.35，碱提时间59min，酸沉pH3.41，酸沉时间10min。在此条件下蛋白质提取率可达54.24%。酸沉液采用10ku超滤膜进一步提取蛋白，最终总提取率可达93.42%。

马铃薯淀粉废水，碱提酸沉，超滤，蛋白质

马铃薯蛋白是良好的蛋白质来源，将马铃薯淀粉废水中的蛋白质提取再利用不仅可以改善环境，而且能够回收一定的粗蛋白，提高马铃薯淀粉生产的附加值。目前有报道称可采用磁性壳聚糖微球吸附以及臭氧鼓泡等新型的方法回收马铃薯淀粉废水中的蛋白质。所谓磁性壳聚糖是指内部含有磁性金属或金属氧化物（铁、钴、镍及其氧化物）的超细粉末且具有磁响应性的壳聚糖微球，其中含有重金属物质，因此回收蛋白质的安全性等需进一步验证。传统提取蛋白质的方法主要有：加热法、加酸法、絮凝沉淀法以及超滤法。加热提取蛋白的提取率达到了75%左右，但是加热使蛋白产生不可逆沉淀，对蛋白质品质影响很大；加酸提取蛋白的得率可达40%；絮凝法对废水的COD去除率较高，但是对蛋白质的回收率却很低。目前，国内采用膜技术回收马铃薯淀粉废水中蛋白质的研究很少，仅有少数的实验室研究报道[1]。废液直接用于超滤不仅对膜造成很大的压力，影响膜的寿命；而且经济效益较低。本研究首先采用碱提酸沉提取废液蛋白质，在此基础上结合超滤进一步提取蛋白，以期在有效减轻直接超滤对膜造成损耗的前提下，充分提取废液中的蛋白质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

考马斯亮蓝 成都科龙化工试剂厂；氢氧化钠，盐酸，亚硫酸氢钠。

752紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；QL-901漩漩涡震荡仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PHS-25型数显酸度计 雷磁分析仪器厂；JA 2003A、JA50002电子分析天平 上海精天；101型电热鼓风恒温干燥箱 余姚金惠电子设备厂；CMSC300超滤杯 上海摩速科学器材有限公司；entrifuge 5810型高速离心机，JYL-C022型九阳料理机。

1.2 实验方法

1.2.1 淀粉废水的制备 将马铃薯切碎后用打浆机绞碎，加水（1∶4）、1%亚硫酸氢钠搅拌10min，再静置15m in，用双层滤布过滤，滤液静置2h后，在6000r/m in转速下离心10m in，取上清液作为实验水样。在搅拌过程中加入亚硫酸氢钠的目的是防止水样褐变[2]。

1.2.2 碱提酸沉法提取马铃薯淀粉废水蛋白 淀粉废水→碱液提取→6000r/min离心→调酸沉淀→8000r/min离心取上清液→碱液提取→6000r/min离心→调酸沉淀→8000r/min离心→蛋白质沉淀→冷冻干燥→粗蛋白粉

1.2.3 碱提酸沉法提取马铃薯废水蛋白的单因素实验设计 以蛋白质的提取率为指标评价碱提酸沉法提取马铃薯废水蛋白的效果，单因素实验的基本条件定为：碱提pH为8.0，提取时间为60min，酸沉pH为4.5，酸沉时间为10m in。改变其中一个条件，固定其他条件以分析碱提pH、碱提时间、酸沉pH、酸沉时间对蛋白提取率的影响。各因素梯度分别为：碱提pH：7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10；碱提时间：1、5、30、60、120m in；酸沉pH：2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5；酸沉时间：5、10、20、30、40m in。每个因素重复实验3次，结果取平均值。对上清液进行二次碱提酸沉后，测上清液蛋白质含量。

1.2.4 三因素二次回归正交旋转实验设计 根据单因素实验结果，选取了三个主要影响因子：碱提pH、碱提时间、酸沉pH。再按中心组合实验设计方法设计三因素三水平共23组实验的实验方案。实验因素水平和编码如表1所示。

表1 三因素三水平实验设计Table 1 Factors and levels for the experiment

1.2.5 酸沉上清液中蛋白超滤提取 使用10ku聚砜膜在压强0.12~0.15MPa、温度25℃的条件下对酸沉上清液进行超滤，采用考马斯亮蓝法测定超滤浓缩液的蛋白质含量，并以蛋白质回收率为指标进行评价。

1.2.6 蛋白质含量的测定 溶液中蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[3]。在595nm波长下进行比色，以牛血清白蛋白浓度1g/L为标准液，绘制标准曲线，然后测定各样品。蛋白提取率按以下公式计算。

蛋白提取率（%）=（提取后上清液蛋白含量/原液蛋白含量）×100

2 结果与讨论

2.1 碱提酸沉法提取马铃薯废水蛋白的单因素实验

2.1.1 碱提pH对蛋白质提取率的影响 由图1得知，在pH7~9.5范围内蛋白质的提取率总体呈现上升趋势，pH 9.5时达到51.95%±0.029%，随着pH进一步上升，提取率的增加不显著。碱性条件可增溶蛋白的原因主要在于增加了蛋白负电荷的携带量，使维系蛋白在溶液体系的平衡力加强。由实验结果可见，当pH在7~9.5范围内时，蛋白负电荷携带量随着pH的增加而增加，蛋白溶解性增加。pH大于9.5时，随着pH的进一步增加，蛋白的电荷携带量因趋于饱和而不再明显增加，蛋白得率也就不再明显提高。此外，强碱条件下蛋白液的粘度增加，不仅不利于后续的离心分离，而且会造成蛋白质营养价值的降低[4]。综合考虑以上因素，初步选取较适碱提pH为9.5。

图1 碱提pH对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effectof alkaliextraction pH on the extraction yield of protein

2.1.2 碱提时间对蛋白质提取率的影响 由图2可知，随着碱提时间的延长，蛋白质的提取率先上升后下降，在60m in时提取率最大，达到51.10%±0.052%。在一定时间范围内，随提取时间的延长，蛋白质的溶出率提高，蛋白质的提取率增大。由实验结果得出，当提取时间达到60m in时，蛋白质的溶出达到了动态平衡，蛋白质的提取率达到了峰值，而随着时间的进一步延长，废水中的残余淀粉可能与蛋白质结合，从而导致蛋白质难以溶出，提取率降低。因此，初步选取最适提取时间为60m in。

图2 碱提时间对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effectof alkaliextraction time on the extraction yield of protein

图3 酸沉pH对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effectof acid precipitation pH on the extraction yield of protein

2.1.3 酸沉pH对蛋白质提取率的影响 由图3可知，在酸沉pH 2.5~3.5范围内，蛋白提取率呈先上升后下降趋势，且在pH 3.0时达到第一个峰值，提取率为50.76%±0.0040%，在pH3.5~5.5范围内，蛋白质提取率同样呈先上升后下降趋势，且在pH 4.0时达到第二个峰值，提取率为50.95%±0.052%。等电点时蛋白质分子颗粒在溶液中不存在同电荷的相互排斥作用，其颗粒极易相互碰撞凝聚而沉淀析出，因此，此时溶液中蛋白质的溶解度最小。由实验结果看出，酸沉过程中出现了两个等电点，出现此情况的可能原因是由于碱提取导致多种蛋白组分同时溶出，而不同蛋白质有不同等电点[5]。综合考虑各因素，初步选取较适酸沉pH为4.0左右。

2.1.4 酸沉时间对蛋白质提取率的影响 由图4可以看出，蛋白质的提取率与酸沉时间的曲线呈先上升后下降的趋势，在沉淀时间为20m in时达到峰值，此时蛋白质的提取率达到了48.26%±0.023%。蛋白质处于等电点时，呈絮状沉淀物，此现象称蛋白质的结絮作用。结絮作用所生成的絮状物不稳定，随着时间的延长，可再溶于溶液中。由实验结果得知，在沉淀时间为20m in时，蛋白质的提取率达到了峰值，随着时间进一步延长，结絮后的蛋白质可能再溶于溶液而导致提取率降低。与其他影响因素相比，酸沉时间研究范围内蛋白提取率波动较小，即酸沉时间对蛋白提取率的影响较小，因此在进一步的工艺优化实验中，不再考虑酸沉时间的影响，综合考虑后固定为10m in。

图4 酸沉时间对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of acid precipitation time on the extraction yield of protein

2.2 碱提酸沉法制备马铃薯废水蛋白工艺条件的优化和最佳因素水平的选择

三因素二次回归正交旋转组合设计结构矩阵与结果如表2所示，其中实验序号由Design-Expert7.1.3软件随机产生。

2.2.1 模型的建立及其显著性检验 利用Design-Expert7.1.3软件对表2实验数据进行多元回归拟合，得到马铃薯淀粉废水蛋白质提取率对碱提pH（A）、碱提时间（B）、酸沉pH（C）的二元多项回归模型为：

对此模型进行显著性检验，结果见表3，回归方程系数显著性结果见表4。

由表3的模型方差分析结果得知，模型的p值为0.0175，达到显著性差异。失拟项的p值为0.0531，大于0.05不显著，所以二次模型成立，因此可用此模型分析和预测碱提酸沉提取马铃薯淀粉废水蛋白工艺的优化。

由表4回归方程系数的显著性检验结果得知，模型的一次项A、B均不显著，C显著；二次项A、B显著，C不显著；交互项均不显著；其中酸沉pH的影响因素最大。

表2 响应面实验设计与结果Table 2 Design of RSM and its experimental values

表3 回归模型分析结果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

表4 回归方程系数的显著性检验Table 4 Significance testof coefficient in regression equation

剔除不显著项后的方程模型为：Y=53.33-2.77C-2.62A2-2.51B2

2.2.2 马铃薯淀粉废水蛋白质碱提酸沉提取工艺的响应面分析与优化 根据回归模型做出相应的响应曲面图见图5~图7。

图5~图7直观的反映了各因素交互作用对蛋白质提取率的影响。碱提pH与碱提时间之间的交互作用、碱提pH和酸沉pH之间的交互作用、碱提时间和酸沉pH之间的交互作用均不显著。且酸沉pH、碱提pH对马铃薯蛋白提取率的影响最为显著；而碱提时间次之。

图5 碱提pH与碱提时间交互作用对蛋白质提取的影响Fig.5 Combined effects of alkaliextraction pH and time on the extraction yield of protein

图6 碱提pH与酸沉pH交互作用对蛋白质提取的影响Fig.6 Combined effects of alkaliextraction pH and acid precipitation pH on the extraction yield of protein

图7 碱提时间与酸沉pH交互作用对蛋白质提取的影响Fig.7 Combined effects of alkaliextraction time and acid precipitation pH on the extraction yield of protein

2.2.3 提取条件的优化[6-7]通过Design-Expert7.1.3软件分析，得出碱提酸沉提取马铃薯淀粉废水蛋白的最优工艺为碱提pH 9.35、碱提时间58.67m in、酸沉pH 3.41，酸沉时间10m in，该条件下蛋白质提取率预测值为55.02%。根据上述最优提取工艺，结合实际操作情况，将提取工艺参数修正为碱提pH 9.35、碱提时间59m in、酸沉pH 3.41，酸沉时间10m in，进行验证实验，测得的平均蛋白质提取率为54.24%，与预测值相近，证实了该模型的合适性。

2.2.4 酸沉上清液中蛋白超滤提取 酸沉液进一步超滤回收，蛋白质回收率达到了85.62%。结合碱提酸沉工艺总提取率可达93.42%。

超滤的分离机理主要是物理筛分作用，而膜的化学性质对分离特性影响不大[8]。超滤膜具有较高的多孔性，只能阻挡具有低渗透压的大分子（如蛋白质或胶体）通过。较小的溶质分子与水一起被搬运通过滤膜。因此超滤可在较低的压力下进行[9]。张泽俊等[10]的研究表明，使用切割分子量1.5万的醋酸纤维素膜对马铃薯废水进行处理可截留85%的蛋白质；吕建国等[11]研究表明，使用相对切割分子量2万的PE膜对马铃薯废水进行处理可回收其中约90%的蛋白。但是由于马铃薯废液中含有多种有机物，极易造成膜的严重损伤和堵塞，无法长时间连续高效生产。碱提酸沉与超滤相结合不仅总回收率高，而且采用碱提酸沉进行预处理之后，可有效提取大部分马铃薯废水蛋白，大大减轻膜的压力，对于产业化生产具有积极意义。

3 结论

3.1 通过单因素实验确定了马铃薯淀粉废水蛋白质提取较适条件为：碱提pH 9~10，碱提时间60m in，酸沉pH3~4.5，酸沉时间10min。

3.2 采用响应面分析法对蛋白质提取工艺进优化，建立了二次多项式回归方程数学模型：Y=53.33-2.77C-2.62A2-2.51B2。确定了马铃薯淀粉废水预处理的最适工艺条件为：碱提pH 9.35，碱提时间59m in，酸沉pH 3.41，酸沉时间10m in。在此条件下，蛋白质提取率可达54.24%。

3.3 优化后的碱提酸沉工艺结合超滤技术提取马铃薯淀粉废水中的蛋白质，总得率可达93.42%。

[1]陶德录．马铃薯淀粉废水中提取饲料蛋白和微生态制剂的研究[J]．饲料广角，2007（13）：32－34．

[2]吕文博，王三反，石金晔，等．从马铃薯淀粉废水中提取饲料蛋白的研究[J]．工业安全与环保，2009，35（7）：9－10．

[3]田纪春．谷物品质测试理论与方法[M]．北京：科学出版社，2006：93－94．

[4]HAMADA JS．Use of proteases to enhance solubilization of rice bran proteins[J]．Journal of Food Biochemistry，1999，23（3）：307－321．

[5]MACY．Chemicalcharacterizationand functionalityassessment of protein concentrates from oats[J]．Cereal Chemistry，1983，60（1）：36－42．

[6]张鸣镝，王章存．响应面分析法优化玉米胚芽蛋白的提取工艺研究[J]．农产品加工，2008（7）：174－177．

[7]ABD EL-AAL M H，HAMZA M A，RAHMA E H．In vitro digestibility，physico-chemicaland functionalpropertiesofapricot kernel proteins[J]．Food Chemistry，1986，19（3）：197－211．

[8]周家春．食品工艺学[M]．北京：化学工业出版社，2003：245．

[9]P JFellows．Food processing technology principlesand practice [M]．蒙秋霞，牛宇，译．食品加工技术—原理与实践[M]．北京：中国农业大学出版社，2006：155－156．

[10]张泽俊，苏春元，刘期成．马铃薯淀粉厂工艺废水的综合处理及利用研究[J]．食品科学，2004，25（S1）：134－137．

[11]吕建国，安兴才．膜技术回收马铃薯淀粉废水中蛋白质的中试研究[J]．中国食物与营养，2008（4）：37－40．

Research of protein extracting from potato starch waster-water

REN Qiong-qiong1，CHEN Li-qing1，HAN Jia-dong1，ZHANG Yu-hao1，2，*，MA Liang1，2
（1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400716，China；2.Food Engineering and Technology Research Center of Chongqing，Chongqing 400716，China）

The potato p rotein from starch p roducing waste-water was extrac ted by alkali-solution and acidisolation combined w ith ultra-filtration.The extraction p rocessing was op tim ized by sing le factors and response surface analysis.The results showed that the op timum conditions of extrac tion p rocessing of p rotein from potato starch waste-water by alkali-solution and acid-isolation were as follow：the alkali-solution pH9.35，alkali-solution time 59m in，acid-isolation pH3.41，acid-isolation time 10m in.Under these conditions，the extraction rate of p rotein reached 54.24%.While combined w ith ultra-filtration，the extrac tion rate of p rotein reached 93.42%.

potato starch wastewater；alkali-solution and acid-isolation；ultra-filtration；p rotein

TS235.2

B

1002-0306（2012）14-0284-04

2011－11－15 *通讯联系人

任琼琼（1986-），女，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂与植物蛋白工程。

石柱农业科技综合示范基地科技专项基金。