蛹虫草N102多糖提取条件优化及其抗肿瘤活性研究

逯城宇，张尊凯，刘 艳，张小蕾，张毅君，滕利荣，2，*

（1.吉林大学生命科学学院，吉林长春 130012；2.吉林大学珠海学院，广东珠海 519041；3．新加坡国立大学理学院，新加坡肯特岗 118426）

蛹虫草N102多糖提取条件优化及其抗肿瘤活性研究

逯城宇1，张尊凯1，刘 艳1，张小蕾3，张毅君1，滕利荣1，2，*

（1.吉林大学生命科学学院，吉林长春 130012；2.吉林大学珠海学院，广东珠海 519041；3．新加坡国立大学理学院，新加坡肯特岗 118426）

以蛹虫草高产突变株N102的胞内多糖为研究对象。在单因素实验的基础上采用响应面实验对蛹虫草N102多糖的提取工艺条件进行优化。蛹虫草N102的菌丝体干粉经乙醇除杂、水提、反复冻融、除蛋白、乙醇分级沉淀等方法得到三种多糖组分（2、4和6倍醇沉蛹虫草N102多糖），并采用MTT法分别研究了蛹虫草N102各级醇沉多糖对人宫颈癌细胞Hela体外增殖的影响。结果表明，蛹虫草N102的最佳提取工艺为：提取温度83℃，提取时间3.2h，水料比52∶1（mL∶g）。3次验证实验得到的蛹虫草N102多糖提取率的平均值为7.24%，相对误差为1.16%，可见该模型能较好地预测蛹虫草N102多糖的提取工艺。蛹虫草N102的4倍醇沉多糖（4FPS）对Hela细胞具有较强的抑制作用，当作用时间为72h时，抑制率可达到74.98%，IC50仅1.72mg/mL。

蛹虫草，多糖，提取，响应面，抗肿瘤活性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛹虫草N102 由蛹虫草CICC 14013经亚硝基胍诱变得到，由本实验室保存；人宫颈癌细胞Hela 本实验室保存；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养液 长春博德生物有限公司；MTT、DMSO 生工生物工程（上海）公司；胰蛋白酶、牛血清白蛋白（BAS） 宝泰克生物科技公司；蒽酮、正丁醇、三氯甲烷、无水乙醇、浓硫酸 均为分析纯。

FA1004型电子天平 上海实验仪器厂；HH-66恒温水浴锅 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；TDL-4B高速离心机 上海安亭科学仪器厂；752紫外可见分光光度计 上海分析仪器厂；77530-30LAB冷冻干燥机 美国Labconco公司；FW 100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；RE52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；MC0-18AIC CO2培养箱 日本SANYO公司；IX71倒置相差显微镜 日本OLYMPUS公司；550型酶联检测仪 美国Bio-2Rad公司；可调式微量取液器 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 采用液体深层发酵的方法获得蛹虫草N102的菌丝体[14]，发酵液4800r/m in，离心15m in，弃去上清液，加去离子水洗涤菌丝体2次。菌丝体真空冷冻干燥，用小型机械粉碎机粉碎后过60目筛，即得蛹虫草N102菌丝体干粉。

1.2.2 蛹虫草N102多糖的提取 取菌丝体干粉100g，加入95%乙醇，于30℃振摇过夜，真空抽率回收菌粉，重复一次，风干后，加入一定量的去离子水，于恒温水浴中提取。8000r/m in离心10m in，收集上清液，55℃减压浓缩至1L，离心，收集上清液，于-20℃冷冻24h，室温缓慢融化，4℃，10000r/min离心除去沉淀。反复数次直到无沉淀为止。上清液中加入10mg胰蛋白酶，于37℃水解6h。上清液中加入1/4体积的Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1）充分混匀，静止分层后，12000r/m in离心5min，合并上清液，反复数次至无蛋白层为止。上清液于1×104u的透析袋中去离子水透析48h，收集透析内液，55℃减压浓缩至500m L，分别用2、4、6倍体积的95%乙醇于4℃进行分级沉淀，沉淀冷冻干燥后，称重，即得到蛹虫草N102的2、4、6倍醇沉多糖。

1.2.3 蛹虫草N102多糖提取工艺条件的优化 为了确定蛹虫草N102多糖的最佳水提工艺，采用单因素实验对影响多糖提取率的提取温度、提取时间和水料比三个主要因素进行优化。并在此基础上，根据Box-Benhnken实验设计进行三因素三水平的响应面实验，考察提取温度、提取时间、水料比三个自变量对响应值（多糖提取率）的影响，并得到蛹虫草N102多糖的最佳提取工艺条件。响应面分析的因素水平设计如表1所示。

送谢氏父子走的时候，苏楠说，刚才没告知你们，咱们的谈话我已经录了音。我想提醒你们的是，现在我的委托人的女儿连工作都丢了，失业在家，生活很不容易。你们刚才也承认了，当年是我的委托人救了谢老先生。现在她有难了，你们不应该伸手施救吗？你们竟然借此机会要挟她，索取什么五千块钱误工补助，我觉得这不是一个有良知的人做的事。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.2.4 MTT比色法测定蛹虫草N102多糖抗肿瘤活性收集对数生长期的Hela细胞，以0.25%胰酶消化后，加DMEM培养液吹打成细胞悬液，并接种于96孔板中，每孔100μL，调整细胞浓度至1.0×104个每孔后，于37℃，5%CO2培养箱中培养，至细胞在孔内铺满。换无血清DMEM培养基，孵育24h后，弃培养液，实验组加入150μL样品浓度分别为0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12mg/m L的无血清培养基，对照组则加入等体积的完全培养基，每组设5个复孔，置于37℃、5%CO2条件下培养24、48、72h。每孔加入20μL MTT试剂，继续培养4h。小心弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10m in，再用酶标仪测定OD570，计算抑制率。

1.2.5 分析方法 样品中多糖含量采用蒽酮硫酸法进行测定[15]，还原糖含量采用DNS法进行测定[16]，蛋白质含量采用Brad ford法进行测定[17]。

多糖提取率（w/w，%）=[提取液中多糖含量（g）/原料重量（g）]×l00

多糖得率（w/w，%）=[醇沉粗多糖质量（g）/原料重量（g）]×l00

2 结果与讨论

2.1 蛹虫草N102多糖提取工艺的优化

2.1.1 提取温度对多糖提取率的影响 以30∶1（m L∶g）水料比，分别将蛹虫草N102菌粉悬液于40、50、60、70、80、90℃恒温水浴中浸提4h，8000r/m in离心10m in，分离上清液并测定多糖提取率，结果如图1所示，多糖提取率随着提取温度的增加而增大，当提取温度达到80℃时提取率达到最大值，大于80℃时多糖提取率反而呈下降趋势。

图1 提取温度对多糖提取率的影响Fig.1 Effectof extraction temp on the yield of polysaccharide

2.1.2 提取时间对多糖提取率的影响 以30∶1（m L∶g）水料比，将蛹虫草N102菌粉悬液于80℃恒温水浴中，分别浸提1、2、3、4、5h，8000r/m in离心10m in，分离上清液并测定多糖提取率。结果如图2所示，随提取时间的增长蛹虫草N102多糖提取率逐渐增大，提取时间达到3h时蛹虫草N102多糖提取率达到最大，其后多糖提取率则趋于平稳。

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effectof extraction time on the yield of polysaccharide

2.1.3 水料比对多糖提取率的影响 分别以20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（m L∶g）水料比，将蛹虫草N102菌粉悬液于80℃恒温水浴中，浸提3h，8000r/min离心10m in，分离上清液，测定蛹虫草N102多糖提取率。结果如图3所示，水料比未达到50∶1（m L∶g）时，蛹虫草N102多糖提取率随着水料比的增加而增大，水料比为50∶1（m L∶g）时蛹虫草N102多糖提取率达到最大值，然后随着水料比的增大蛹虫草N102多糖的提取率趋于稳定。

图3 水料比对多糖提取率的影响Fig.3 Effectof solvent/solid ratio on the yield of polysaccharide

2.1.4 响应面法优化蛹虫草N102多糖的提取工艺 根据单因素实验的结果，以提取温度、提取时间、水料比为自变量，菌丝体多糖提取率为响应值，采用响应面分析法对三个因素进行优化，以得到最佳的蛹虫草N102多糖提取工艺。

根据表1设计因素水平，对提取温度（X1）、提取时间（X2）和水料比（X3）分别进行编码如下：X1=（Z1-80）/10，X2=（Z2-3）/1，X3=（Z3-50）/10。表2显示了响应面分析方案及结果，采用SASRSREG对表2中数据进行分析，得到响应值对三个自变量的多项二次回归方程为：

采用F检验对回归方程中各自变量对响应值（Y）的显著性进行判定，回归结果如表3所示。方程中X1X2、X2X3为影响显著项（p＜0.05），X1、X2、X3为影响极显著项（p＜0.01），一次项（p=0.00105）和平方项（p=0.00022）均为极显著项，而交互项（p=0.02655）为影响显著项，这说明各自变量对响应值的影响除了线性关系外，平方项和交互项对响应值的影响也很大，而回归方程的相关系数R2为0.9840，说明该模型可较为准确描述各自变量与响应值之间的相互关系。

表2 Box-Benhnken实验设计方案及实验结果Table 2 Box-Behnken experiments design and the results of experiments

表3 回归分析结果Table 3 Statistical results of regression analysis

图4为回归模型的响应面及等高线图，可以清晰直观的反映三个因素对蛹虫草N102多糖提取率的影响。由图4（A）可以看出，其等高线呈椭圆形，椭圆形的轴线与X1和X2坐标轴间存在一个夹角，图中等高线较为密集，且X1（提取温度）处于不同水平时，X2（提取时间）对响应值Y的影响变化规律不同；同样，X2处于不同水平时，X1对Y值的影响也呈不同规律变化，表明提取温度和提取时间的交互作用对蛹虫草N102多糖的提取率影响显著（p=0.02009）。由图4（B）可以看出，X1（提取温度）与X3（水料比）对Y值的影响规律随另一因素的改变并不明显，说明提取温度与水料比的交互作用对蛹虫草N102多糖提取率的影响不显著（p=0.92924）。由图4（C）可以看出，其等高线呈椭圆形，椭圆形的轴线与X2和X3坐标轴间存在一定夹角，图中等高线较为密集，且X2（提取时间）处于不同水平时，X3（水料比）对Y值的影响的变化规律不同；同样，X3处于不同水平时，X2对响应值的影响也呈不同规律变化，表明X2、X3的交互作用对蛹虫草N102多糖的提取率影响显著（p=0.02009）。对图4的直观分析结果与回归分析结果一致。

采用SAS工具箱对回归方程进行一阶求偏导，得到响应值（Y）处于最大值时的X1、X2、X3的编码值分别为：X1=0.3048，X2=0.1803，X3=0.1939，即蛹虫草N102多糖提取的最佳提取工艺条件为：提取温度为83℃，提取时间为3.2h，水料比为52∶1（m L∶g），在此条件下，预测多糖的提取率为7.16%。

图4 响应面图和等高线图Fig.4 Response surfacegraphs and contour plots

2.1.5 验证实验 在蛹虫草N102多糖的最佳提取条件下，进行3次重复验证实验。得到的蛹虫草N102多糖提取率分别为7.28%、7.19%、7.25%，平均值为7.24%，与理论预测值的相对误差仅为1.16%，证实了该模型的预测性。由此得到蛹虫草N102菌丝体多糖的最佳提取工艺为：提取温度为83℃，提取时间为3.2h，水料比为52∶1（m L∶g）。

2.2 蛹虫草N102多糖的制备

采用乙醇分级沉淀制备蛹虫草N102菌丝体2倍醇沉（2FPS）、4倍醇沉（4FPS）和6倍醇沉（6FPS）多糖。乙醇沉淀法能去除多糖中的杂质，并且根据乙醇的浓度，将不同分子量的物质进行分级。2FPS、4FPS和6FPS的得率、蛋白质含量、还原糖含量及总糖含量如表4所示，4FPS的纯度最高且得率最大，其中多糖含量可达到73.43%，而蛋白质含量仅为1.39%，且多糖得率为1.97%，分别是2FPS和6FPS得率的4.58倍和2.94倍。由此可见，4倍乙醇沉淀是分离蛹虫草N102多糖的有效手段。

表4 2FPS、4FPS和6FPS的得率、蛋白质及糖含量Table 4 The yield，protein and sugar contentof 2FPS 4FPS and 6FPS

2.3 蛹虫草N102多糖抗肿瘤活性研究

2.3.1 2FPS对Hela细胞体外增殖的影响 2FPS对Hela细胞体外增殖的作用与给药浓度的关系密切，如图5所示。当作用时间相同时，随给药浓度的增大2FPS对Hela细胞的体外抑制作用也显著提高。当作用时间为24h时，在给药浓度范围内，2FPS对Hela细胞的抑制作用不超过15%。作用时间达到48h后，2FPS对Hela细胞的抑制作用大幅度提高。当作用时间增大时，2FPS对Hela细胞的抑制作用也显著提高，作用时间由24h增大到72h，5.12mg/m L的2FPS对Hela细胞的抑制作用由14.63%增大到50.25%。当2FPS对Hela细胞作用72h时其IC50为4.70mg/m L。

图5 2FPS对Hela细胞体外增殖的影响Fig.5 Inhibition of proliferation of Hela cells by 2FPS

2.3.2 4FPS对Hela细胞体外增殖的影响 4FPS对肿瘤细胞的抑制率随作用时间明显提高，如图6所示。4FPS对Hela细胞的体外抑制作用具有明显的时间依赖性。在作用时间较短时（24h），给药浓度低于0.64mg/m L时，4FPS对Hela细胞的增殖表现出促进作用；给药浓度高于0.64mg/m L时，4FPS逐渐对Hela细胞呈现出一定的抑制作用。当作用时间达到48h时，4FPS对Hela细胞增殖的抑制作用明显增大，当给药浓度达到5.12mg/m L时，4FPS对Hela细胞的抑制作用可达到57.11%。在作用时间为72h时，随着给药浓度的增加，4FPS对Hela细胞的体外增殖的抑制作用大幅度提高，抑制率由11.79%增大到74.98%。当4FPS对Hela细胞作用时间为48和72h时，其IC50分别为3.06和1.72mg/m L。

图6 4FPS对Hela细胞体外增殖的影响Fig.6 Inhibition of proliferation of Hela cells by 4FPS

2.3.3 6FPS对Hela细胞体外增殖的影响 如图7所示，6FPS对Hela细胞的体外增殖具有一定的抑制作用，且抑制作用具有较强的浓度依赖关系，而作用时间对抑制作用也有一定的影响。当给药浓度低于1.28mg/m L时，6FPS对Hela细胞作用48h时对其抑制作用最强，其次分别为作用72h和24h时；当给药浓度高于1.28mg/m L时，随作用时间的延长6FPS对Hela细胞增殖的抑制作用逐渐增大，但即使在最大给药浓度时，6FPS对Hela细胞作用也低于40%。

图7 6FPS对Hela细胞体外增殖的影响Fig.7 Inhibition of proliferation of Hela cells by 6FPS

3 结论

本文在单因素实验的基础上，采用三因素三水平的响应面分析实验预测蛹虫草N102多糖的最佳提取工艺为：提取温度83℃，提取时间3.2h，水料比52∶1（m L·g-1），此时预测多糖提取率为7.16%。验证实验中蛹虫草N102多糖提取率的平均值为7.24%，与理论预测值的相对误差为1.16%，可见该模型能较好地预测蛹虫草N102菌丝体多糖的提取率。采用乙醇分级沉淀的方法分离得到三种多糖组分，MTT法研究结果表明，2FPS、4FPS和6FPS对Hela细胞体外增殖的影响与作用时间和给药浓度具有显著的量效关系。其中4FPS对Hela细胞具有较强的抑制作用，当作用时间为72h时，4FPS对Hela细胞体外增殖的IC50仅1.72mg/m L。通过分析证实4FPS的多糖含量最高，可见蛹虫草N102多糖具有较强的抗肿瘤作用。

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Study on the optim ization of the extraction conditions and the anticancer activity of polysaccharide from the highly-yielding strain Cordyceps Militaris N102

LU Cheng-yu1，ZHANG Zun-kai1，LIU Yan1，ZHANG Xiao-lei3，ZHANG Yi-jun1，TENG Li-rong1，2，*
（1.College of Life Science，Jilin University，Changchun 130012，China；2.ZhuhaiCollege，Jilin University，Zhuhai519041，China；3.Faculty of Science，National University of Singapore，Kent Ridge 118426，Singapore）

The polysaccharide in highly-yield ingmutagenic strain Cordycepsm ilitaris N102 was studied.Response surface methodology（RSM）was app lied to op tim ize the extrac tion conditions of polysaccharide in Cordyceps m ilitaris N102 m ycelium.After repeated freeze-thaw，dep roteinization，dialysis and ethanol p recip itation，crude polysaccharide of Cordycepsm ilitaris N102（2FPS，4FPS and 6FPS）was ob tained.The MTT assay was app lied to study the inhibitory activity of crude polysaccharide of Cordycepsm ilitaris N102 on the Hela cells p roliferation. The results indicated that the op timum p rocess cond itions for the extraction cond itions of adenosine were as follow：extracting tem perature was 83℃，extracting time was 3.2h and solvent/solid ratio was 52∶1（m L∶g）.The average yield of adenosine in 3 validation experiments was 7.24%.The relative error was 1.16%.The results of MTT assay showed that polysaccharides p resented inhibitory activity on the cells p roliferation of Hela.After 72h incubation，the inhibition rate of Hela was 74.98%，and the IC50was only 1.72mg/m L.

Cordycepsm ilitaris；polysaccharide；extrac tion；response surface methodology；anticancer activity

TS201.2+3

A

1002-0306（2012）14-250-05

2012－03－06 *通讯联系人

逯城宇（1990－），男，学士，主要从事生物技术制药方面的研究。