HPLC法测定复方氨基酸注射液(18AA-Ⅳ)中5-羟甲基糠醛的含量*

张 莉，黄哲甦

(天津市药品检验所，天津 300070)

复方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)临床上主要用于改善外科手术前后病人的营养状态，适用于各种疾病引起的营养不良，同时作为节氮疗法补充营养。复方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)质量标准现收载于国家药品标准新药转正标准第44册。5－羟甲基糠醛(5－hydroxymethylfurfural)为该制剂中的原料组分葡萄糖在放置及加热灭菌过程中的分解产物。由于5－羟甲基糠醛损害人体横纹肌和内脏，因此在含有葡萄糖成分的输液类制剂中应严格控制5－羟甲基糠醛的含量［1］。原国家标准采用颜色反应(不产生樱桃红色)来控制样品中的5－羟甲基糠醛量，该法为定性反应，准确性差。为进一步准确测定复方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)中5－羟甲基糠醛的含量，确保人民用药安全。本文建立了高效液相色谱法测定复方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)中5－羟甲基糠醛的含量，方法简便、准确、重复性好。

1 仪器与试药

1.1 仪器LC－20A岛津液相色谱仪，梅特勒XS205电子天平。

1.2 试药 5－羟甲基糠醛对照品(CHEMICAL LTD，批号L460k10，纯度:98%);复方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)(天津天安药业股份有限公司，批号201003141、 201003154、 201007311、 201008193、201009261、201101154、201103281 和 201103293);甲醇(色谱纯)、磷酸二氢钾和四丁基氢氧化铵溶液(分析纯)、蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex PRODIGY ODS(3)C18100A 分析柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:磷酸盐缓冲液［0.1 mol/L的磷酸二氢钾溶液和四丁基氢氧化铵溶液(取0.01 mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH值至4.5)等量混合］－甲醇(95∶5);流速:1.0 m l/min;检测波长284 nm;柱温:40℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取5－羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1 ml中含15μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品直接作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方量制备不含有葡萄糖的样品作为阴性对照溶液。

2.3 方法专属性考查 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液依法测定记录色谱图，见图1。结果，阴性对照溶液在对照品相同保留时间处无吸收峰，表明样品中无干扰5－羟甲基糠醛的成分存在。

图1 对照品(A)供试品(B)阴性对照(C)HPLC色谱图

2.4 线性关系考查 精密量取150μg/m l的5－羟甲基糠醛对照品储备液，用水配制成浓度0.029 89、0.119 6、0.597 8、1.793 4、2.989、5.978、8.967、11.956、14.945、17.934、20.923 和 23.912 μg/ml的系列对照品溶液。分别精密量取上述对照品溶液20μl，照“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以浓度为横坐标，相对应的峰面积为纵坐标，进行线性回归。结果表明5－羟甲基糠醛在0.029 9～23.912μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。回归方程为Y=79 420.25 X+441.18(r=0.999 6)。

2.5 检出限试验 取5－羟甲基糠醛对照品，用水稀释制成不同浓度的溶液，在选定色谱条件下，按信噪比为3对最低检测量进行测定。结果表明，5－羟甲基糠醛最低检出浓度 0.03 μg/m l，检出限为 0.3 ng。

2.6 溶液的稳定性 取供试品溶液分别在0、2、4、6和8 h进样，考查溶液室温放置稳定性，结果表明，供试品溶液在8 h内稳定。

2.7 回收率试验 取5－羟甲基糠醛对照品，配制3个浓度(300、375和450μg/ml)的样品溶液，每个浓度取3份，分别精密量取1ml，置25ml量瓶，加空白辅料溶液稀释至刻度。照“2.1”项下色谱条件进行分析，结果平均回收率为99.10%，RSD为1.08%。

表1 5-羟甲基糠醛回收率试验结果(n=9)

2.8 中间精密度试验 取本品(批号201103281)，由不同人员，不同日期，在不同仪器上测定含量，RSD为1.60%。

2.9 样品中5－羟甲基糠醛含量测定 取8批复方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)样品，按本法测定5－羟甲基糠醛的含量，结果见表2。

表2 样品中5-羟甲基糠醛含量测定结果

3 讨论

3.1 对于含有葡萄糖成分的输液制剂，其中所含5－羟甲基糠醛的检查方法中，干扰较少、准确度较高的为HPLC法，《中国药典》2005年版二部首次收载了采用该法检查葛根素葡萄糖注射液中5－羟甲基糠醛的含量。由于5－羟甲基糠醛是作为杂质检查，因此检测波长的选择较为重要，否则将影响其检出，甚至漏检。5－羟甲基糠醛的最大吸收波长为284 nm，因此HPLC法检查时该波长应为首选检测波长。

3.2 流动相的选择，参考了《中国药典》2010年版二部收载的含有葡萄糖成分的输液制剂中有关物质5－羟甲基糠醛测定的色谱条件。经反复试验，最终选定胞磷胆碱钠葡萄糖注射液［2］有关物质项下的色谱条件适宜测定复方氨基酸注射液(18AA－Ⅳ)中5－羟甲基糠醛的含量，分离效果较好。

3.3 目前已批准的含有葡萄糖成分的输液制剂大多对5－羟甲基糠醛限度进行控制，但限度范围不一。一般约为0.02%(以葡萄糖计)。根据《中国药典》2005年版二部葡萄糖注射液中5－羟甲基糠醛检查的规定，供试品葡萄糖溶液的浓度为10 mg/ml，“在284 nm的波长处测定，吸光度不得大于0.32”。初步推测《中国药典》所规定的“吸光度不得大于0.32”时相对应的5－羟甲基糠醛浓度约为2μg/ml，即5－羟甲基糠醛的限度为0.02%(以葡萄糖计)。本方法根据此限度确定了对照品溶液的浓度。

3.4 该制剂8批样品中含5－羟甲基糠醛很少，但是在生产和储藏过程中葡萄糖容易降解生成5－羟甲基糠醛。因此有必要对该制剂的5－羟甲基糠醛含量进行控制，以确保用药安全。

1 何伍，凌霄.含葡萄糖注射液中5－羟甲基糠醛限度的检测方法.中国医药工业杂志，2008，39(1):47

2 中国药典.二部.2010:603