针与灸血清对RBL-2H3肥大细胞内钙含量的调整作用

张金铃，崔 巍，吉长福，崔山佳，孙海舒，张守信，蒋 瑾，罗明富、4△

(1.中国中医科学院针灸研究所，北京 100700;2.首都医科大学附属北京安贞医院北京北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029;3.中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700)

胃溃疡的患病率为5% ～10%［1-2］，目前西医治疗主要采用杀灭幽门螺旋杆菌及抑制胃酸等措施，近期效果好，停药后复发率高［3］且副作用多，价格贵。针灸治疗该病副作用小，有广泛的治疗应用前景，但机制尚不明确，故本实验就针与灸治疗胃溃疡模型大鼠的异同为切入点，进一步摸索针灸作用的机理。通过细胞培养及活细胞内游离钙离子Fluro-3分子探针标记，观察针与灸的细胞分子水平作用机制，从而分析肥大细胞的功能活动与针灸作用的相关性。

1 材料与方法

1.1 造模

大鼠损伤性胃溃疡模型制备方法的具体操作:注射器去针头，在连接针头处安装细铜管，将配制好的HCL吸入注射器中，铜管沿大鼠食管插入胃中后缓慢推入药物，用于造成胃黏膜急性损伤。

1.2 制备血清

血清的无菌操作制备改良方法:将大鼠腹主动脉暴露，选取普通型10ml静脉取血管，将静脉针插入腹主动脉后，按住末端插入无菌一次性取血管取血，静置40min后离心吸取血清到无菌管中，冻存于－20℃以下保存备用。

1.3 针与灸的施治方法

取足三里和胃腧穴;电针1mA，频率2/15Hz，每次20min，连续3d;艾灸同样取足三里和胃腧穴每次每穴2柱，连续3d。

1.4 分组

实验分为正常对照组、胃溃疡模型组、针刺模型组、艾灸模型组4组。取4组大鼠血清分别加入培养的肥大细胞皿中，作用12h和24h后，采用Fluro-3分子探针标记，流式细胞仪检测细胞内钙离子的荧光值变化，从而动态分析探索针灸穴位作用于经络皮部的机制。

2 结果

2.1 针与灸血清作用于培养的肥大细胞12h后的效应观察

表1显示，加入模型组血清后细胞内荧光值升高，与正常组比较差异有显著性(P＜0.01)，可见溃疡使细胞内钙离子升高，出现了钙超载的现象，模型成功。而针刺组与模型组比较，肥大细胞内荧光值明显下降(P＜0.01)，说明针刺溃疡模型大鼠细胞内钙离子浓度没有上升;艾灸组与模型组比较差异显著(P＜0.01)，说明溃疡大鼠施艾灸后，肥大细胞内未出现钙超载现象。艾灸与针刺差异不显著。

2.2 针与灸血清对肥大细胞作用24h后的效应观察

表2显示，加入血清24h后，模型组与正常组比较未见明显差异(P＞0.05)，针刺组和艾灸组与模型组比较差异亦不显著，说明针与灸血清24h时对肥大细胞没有表现出调节作用，针灸作用可能有时间窗口限制。

表1 加入针与灸血清12h对培养肥大细胞钙超载的阻抑作用(珋x±s)

表2 针与灸血清加入24h后对培养肥大细胞内钙含量的调节作用(珋x±s)

3 讨论

RBL-2H3是1978年美国国立牙科研究所的免疫学实验室从Wistar大鼠嗜碱性细胞中分离和克隆出来的细胞株。这些细胞具有高亲和力的IgE受体。通过集聚这些受体或与钙离子载体协同作用可以激活它们分泌组胺及其他递质。这株细胞广泛地用于研究细胞分泌的不同方面，包括细胞内钙浓度改变、磷酸脂酶激活、蛋白激酶和小 G蛋白的作用［4、5］。肥大细胞作为效应细胞一旦被激活即释放其预先合成和新产生的介质如组胺、IL-4等细胞因子，从而在生理和病理条件下参与调节细胞的生长、分泌和迁移等。有研究显示，IL-12不能刺激肥大细胞分泌IL-6，但能通过激活ERK信号传导通路实现刺激肥大细胞分泌 IL-13［6］。研究［7］发现，肥大细胞胞质钙离子浓度升高并持续稳定在最大值平台时能够获得最佳的脱颗粒率。也就是说，细胞内钙离子升高后可促使肥大细胞脱颗粒。电针和手针实验同样发现肥大细胞脱颗粒现象［8、9］。穴位区肥大细胞参与了激光针灸镇痛效应，而肥大细胞的脱颗粒现象是产生此效应的一个重要环节，肥大细胞可由不同途径激活而产生相似效应［10］。本课题采用体外培养活细胞的方法，研究针灸作用后的组织液血清直接作用于培养的肥大细胞并观察钙离子的变化，从而直观地探讨针灸的作用机制是否为通过调节胞内钙离子浓度来发挥功能。

荧光分子探针Fluo-3AM是以钙的螯合剂EDTA为基础合成的，其乙酰羟甲基酯(AM)形式无荧光，游离态也无荧光。Fluo-3AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，Fluo-3AM的荧光非常弱，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-3AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内。Fluo-3AM可以和钙离子结合，结合后荧光强度可增强50～100倍，因此Fluo-3AM可以反映出钙离子浓度。既往神经细胞实验表明，其可作为显示细胞内钙离子浓度的理想标记物［10、11］。Fluo-3AM 的常用浓度为 0.5～5μmol/L，通常用含有0.5～5μmol/L的 Fluro-3AM溶液和细胞一起于20℃ ～37℃孵育15min进行荧光探针装载。随后适当洗涤，洗涤后可以考虑适当再孵育以确保分子探针在细胞内完全转变成Fluro-3，然后在流式细胞仪上进行检测。每个样本检测10000个状态良好的活细胞，以增加结果的可靠性与稳定性。

近来文献报道，肥大细胞敏化后，刺激细胞内钙释放和细胞外钙离子内流，细胞内钙离子浓度升高，会引起细胞膜通透性增加，进一步引起细胞脱颗粒、合成细胞因子并释放引起周围组织和器官发生炎症反应［12～14］。肥大细胞(MC)是Ⅰ型变态反应速发相的主要靶细胞，也是Ⅰ型变态反应性炎症的主要启动细胞［14］。可见，肥大细胞的脱颗粒反应是机体的一种防御反应，也是速发型变态反应和炎症等病理反应的基础［15］。然而肥大细胞脱颗粒释放的炎症因子又可激活临近的肥大细胞脱颗粒，启动脱颗粒的自身放大机制［15、16］，引起更大范围的炎症反应，它的过度应激会导致组织损伤。本实验结果表明，培养的肥大细胞加入损伤性胃溃疡模型大鼠血清12h后，细胞内游离钙离子升高，可能是损伤性胃溃疡大鼠的血清中含有某些应激活性因子，促使细胞内钙离子升高，从而引起肥大细胞脱颗粒等反应。而针与灸作用于损伤性胃溃疡模型大鼠后，使血清中产生了某种分子拮抗胞内钙离子浓度的升高，从而抑制细胞膜通透性增加的通路，阻抑了肥大细胞脱颗粒的自放大功能，减轻过度炎症反应。但是加入血清24h后，针与灸血清的阻抑肥大细胞内钙离子升高的作用没有发挥出来，说明针与灸的作用可能有时间窗口限制。

本实验通过血清学方法深入探索活细胞状态下针灸对离体肥大细胞内钙离子的效应规律，直观地探索针灸的肥大细胞内钙通路效应机理，对揭示针与灸的细胞内钙信号作用通路提供了物质基础，对进一步解释经络实质及经穴组织物质激活路径及物质交换机理有重要意义。

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